| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 附图清单 | 第11-13页 |
| 附表清单 | 第13-14页 |
| 主要缩略词和符号表 | 第14-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-25页 |
| 1 研究背景 | 第15-16页 |
| ·昆虫病原真菌防治害虫发展历史 | 第15页 |
| ·虫生真菌的致病机制 | 第15-16页 |
| 2 几丁质 | 第16-17页 |
| 3 几丁质酶 | 第17-20页 |
| ·几丁质酶的分类 | 第17-19页 |
| ·依据来源的分类 | 第17-19页 |
| ·依据水解几丁质酶特性的分类 | 第19页 |
| ·依据氨基酸顺序同源性的分类 | 第19页 |
| ·几丁质酶基因表达调控 | 第19-20页 |
| 4 真核表达研究 | 第20-22页 |
| ·表达载体和受体菌 | 第20-21页 |
| ·毕赤酵母高效表达的关键问题 | 第21-22页 |
| ·应用前景 | 第22页 |
| 5 实时荧光定量 PCR 技术 | 第22-25页 |
| 第二章 引言 | 第25-26页 |
| 第三章 玫烟色棒束孢几丁质酶基因 Ifuchit2 的 cDNA 和上游序列克隆与分析 | 第26-45页 |
| 1 引言 | 第26页 |
| 2 材料与方法 | 第26-37页 |
| ·材料 | 第26-28页 |
| ·实验菌株 | 第26页 |
| ·主要化学试剂 | 第26页 |
| ·主要培养基 | 第26-27页 |
| ·常用的缓冲液和贮藏液 | 第27页 |
| ·主要的仪器设备 | 第27-28页 |
| ·方法 | 第28-37页 |
| ·玫烟色棒束孢菌丝的制备 | 第28页 |
| ·玫烟色棒束孢菌丝 RNA 与 DNA 的提取 | 第28-29页 |
| ·cDNA 第一链的合成 | 第29-30页 |
| ·cDNA 的特异片段的 RT-PCR 扩增 | 第30-31页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳回收 PCR 产物 | 第31页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| ·克隆转化 | 第32页 |
| ·阳性克隆的菌落 PCR 验证 | 第32-33页 |
| ·序列测定与分析 | 第33页 |
| ·RACE 模板的合成 | 第33-34页 |
| ·cDNA3′端的 RACE-PCR 扩增及 5′Genome Walking 扩增 | 第34-37页 |
| ·玫烟色棒束孢几丁质酶基因 Ifuchit2cDNA 全长及结构基因克隆 | 第37页 |
| ·DNA 步移法扩增 Ifuchit2 基因 5′-上游区序列 | 第37页 |
| ·序列分析 | 第37页 |
| 3 结果与分析 | 第37-43页 |
| ·RNA 的提取 | 第37-38页 |
| ·RT-PCR 得到基因特异性片段 | 第38页 |
| ·玫烟色棒束孢几丁质酶 Ifuchit2 基因全长 cDNA 的克隆 | 第38-39页 |
| ·玫烟色棒束孢 Ifuchit2 基因 cDNA 序列分析 | 第39-41页 |
| ·Ifuchit2 结构基因的获得 | 第41页 |
| ·Ifuchit2 基因上游序列的克隆与分析 | 第41-43页 |
| 4 讨论 | 第43-45页 |
| 第四章 玫烟色棒束孢几丁质酶基因 Ifuchit2 在毕赤酵母中表达及重组蛋白纯化 | 第45-58页 |
| 1 引言 | 第45页 |
| 2 材料与方法 | 第45-56页 |
| ·材料 | 第45-48页 |
| ·菌株 | 第45页 |
| ·主要试剂 | 第45页 |
| ·酶活测定各种试剂制备 | 第45-46页 |
| ·毕赤酵母表达各种试剂的配制 | 第46页 |
| ·主要培养基配方 | 第46-47页 |
| ·SDS-PAGE 电泳使用溶液的配制 | 第47页 |
| ·主要仪器设备 | 第47-48页 |
| ·方法 | 第48-53页 |
| ·Ifuchit2 基因的表达载体的构建 | 第48-49页 |
| ·酵母表达质粒 pPIC9K 制备 | 第49页 |
| ·酶切后的酵母表达质粒 pPIC9K 与目的基因片段 DNA 的连接 | 第49-50页 |
| ·表达载体的酶切鉴定 | 第50页 |
| ·毕赤酵母电转化 | 第50-52页 |
| ·酵母菌感受态细胞制备 | 第50页 |
| ·电击转化 | 第50-51页 |
| ·PCR 鉴定酵母表达重组子 | 第51-52页 |
| ·毕赤酵母多拷贝克隆的筛选 | 第52页 |
| ·重组毕赤酵母工程菌株外源基因的诱导表达 | 第52页 |
| ·几丁质酶酶活测定 | 第52页 |
| ·重组蛋白的纯化及 SDS-PAGE 分析 | 第52-53页 |
| ·结果与分析 | 第53-56页 |
| ·Ifuchit2 基因的表达载体的构建 | 第53页 |
| ·酵母表达载体 pPIC9K-Ifuchit2 的酶切鉴定 | 第53-54页 |
| ·毕赤酵母多拷贝克隆的筛选 | 第54-55页 |
| ·重组蛋白诱导表达、纯化及 SDS-PAGE 分析 | 第55-56页 |
| 3 讨论 | 第56-58页 |
| 第五章 Realtime-PCR 法研究玫烟色棒束孢中两种几丁质酶基因的诱导转录 | 第58-69页 |
| 1 引言 | 第58页 |
| 2 材料和方法 | 第58-61页 |
| ·菌株来源、试剂 | 第58页 |
| ·培养基 | 第58-59页 |
| ·主要仪器 | 第59页 |
| ·实验方法 | 第59-61页 |
| ·玫烟色棒束孢菌丝培养 | 第59页 |
| ·提取玫烟色棒束孢菌丝 RNA 和 DNA | 第59页 |
| ·引物的设计与合成 | 第59-60页 |
| ·标准曲线的制备 | 第60页 |
| ·玫烟色棒束孢两种几丁质酶表达量的绝对定量检测 | 第60-61页 |
| ·数据分析 | 第61页 |
| 3 结果与分析 | 第61-68页 |
| ·玫烟色棒束孢诱导前后 RNA 的提取 | 第61-62页 |
| ·Realtime-PCR 标准曲线的获得与分析 | 第62-66页 |
| ·几丁质酶基因 Ifuchit1 和 Ifuchit2 表达量变化 | 第66-68页 |
| 4 讨论 | 第68-69页 |
| 第六章 结论 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 作者简介 | 第78页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第78页 |
| 参与的科研项目 | 第78页 |
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