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扣囊复膜酵母菌酸性蛋白酶基因在解脂耶罗维亚酵母菌中表达和重组酸性蛋白酶的应用
 
     论文目录
 
摘要第1-7页
Abstract第7-17页
第一章 绪论第17-43页
 0 前言第17页
 第一节 酵母中的酸性蛋白酶第17-24页
  1 酸性蛋白酶第17-18页
  2 酸性蛋白酶的应用第18-19页
   ·在制备乳制品中的应用第18-19页
   ·饲料添加剂第19页
   ·酒精发酵的促进剂第19页
  3 酵母中的酸性蛋白酶第19-22页
   ·酵母与酸性蛋白酶第20-21页
   ·酸性蛋白酶与酵母的致病性第21页
   ·海洋酵母菌与酸性蛋白酶第21-22页
  4 酸性蛋白酶基因的表达调控第22-24页
   ·温度第22页
   ·pH第22-23页
   ·培养基(碳源,氮源和外源蛋白)第23-24页
   ·培养条件第24页
 第二节 酵母的表达系统第24-35页
  1 表达系统第24-25页
  2 酵母菌表达系统第25-28页
  3 酵母表面展示系统第28-35页
   ·表面展示技术第28-29页
   ·酵母表面展示系统第29-31页
   ·解脂耶罗维亚酵母表面展示系统第31-35页
   ·酵母表面展示的应用第35页
 第三节 基因敲除技术及其应用第35-43页
  1 研究背景第35页
  2 利用同源重组的基因敲除第35-41页
   ·同源重组基因敲除的步骤第36-37页
   ·敲除片段的构建方法第37-38页
   ·选择标记基因第38页
   ·标记基因的删除第38-41页
  3 基因敲除的应用第41-42页
   ·在代谢工程方面的应用第41页
   ·其它应用第41-42页
  4 论文研究目的意义和主要内容第42-43页
第二章 酸性蛋白酶基因在 Y. lipolytica 中高效表达及其在牛奶凝固中的应用第43-77页
 0 前言第43-45页
 第一节 扣囊复膜酵母 A11 菌株酸性蛋白酶基因的克隆第45-53页
  1 材料第45-46页
   ·菌株和质粒第45页
   ·试剂第45-46页
   ·培养基第46页
  2 方法第46-50页
   ·扣囊复膜酵母A11 菌株基因组DNA 的提取第46-47页
   ·引物设计第47页
   ·PCR 扩增第47-48页
   ·PCR 结果观察第48页
   ·PCR 产物的回收第48页
   ·PCR 产物与T 载体连接第48页
   ·大肠杆菌超级感受态的制备第48-49页
   ·大肠杆菌转化第49-50页
   ·阳性克隆的筛选第50页
   ·质粒提取第50页
   ·阳性克隆质粒酶切验证第50页
   ·目的片断测序和比对第50页
  3 结果和分析第50-53页
   ·酸性蛋白酶基因扩增,产物回收以及转化质粒验证第50-52页
   ·测序和序列比对、分析第52-53页
 第二节 扣囊复膜酵母 A11 菌株酸性蛋白酶基因的表达第53-63页
  1 材料第53-55页
   ·菌株和质粒第53-54页
   ·培养基第54-55页
   ·试剂第55页
  2 方法第55-59页
   ·总蛋白含量的测定方法第55-56页
   ·酸性蛋白酶酶活检测方法第56页
   ·引物设计第56-57页
   ·PCR第57页
   ·将酸性蛋白酶基因APG 转入Y. lipolytica P01h 流程图第57页
   ·大肠杆菌转化第57-58页
   ·阳性克隆的筛选第58页
   ·质粒提取第58页
   ·将带有酸性蛋白酶基因APG 的线性片段转入酵母Y. lipolytica P01h第58-59页
   ·产酸性蛋白酶重组菌株的筛选第59页
  3 结果与分析第59-63页
   ·PMD19- T -APG 重组质粒构建第59-60页
   ·pINA1317-APG 表达质粒的构建第60-61页
   ·pINA1317-APG 的线性化第61页
   ·含APG 基因的质粒片段转化到Y. lipolytica P01h 和转化子的筛选第61-63页
 第三节 重组酸性蛋白酶的纯化、酶学性质的研究和在牛奶凝固中的应用第63-76页
  1 材料与方法第63-68页
   ·菌种第63页
   ·培养基第63页
   ·总蛋白的测定第63页
   ·酸性蛋白酶酶活的测定第63页
   ·Y. lipolytica Po1h 转化子 71 的培养第63页
   ·酸性蛋白酶粗酶液的制备第63-64页
   ·DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子交换层析第64-65页
   ·超滤浓缩收集液第65页
   ·不连续SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Native 聚丙稀酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)第65-66页
   ·蛋白酶最适反应温度和温度稳定性第66-67页
   ·酸性蛋白酶的最适pH 和pH 稳定性第67页
   ·金属离子对酸性蛋白酶活力的影响第67页
   ·蛋白抑制剂对蛋白酶活性的影响第67页
   ·酸性蛋白酶在牛奶凝聚中的应用第67-68页
  2 结果与分析第68-76页
   ·酸性蛋白酶的分离纯化第68-71页
   ·酸性蛋白酶最适反应温度和温度稳定性第71-72页
   ·酸性蛋白酶的最适pH 和pH 稳定性第72-73页
   ·金属离子对酸性蛋白酶活性的影响第73-74页
   ·蛋白抑制剂对酸性蛋白酶的活性的影响第74-75页
   ·酸性蛋白酶在牛奶凝聚中的应用第75-76页
 本章小结第76-77页
第三章 酸性蛋白酶在 Y. lipolytica 细胞表面上展示及其在牛奶凝固中的应用第77-92页
 0 前言第77-78页
 1 材料第78页
   ·菌株和质粒第78页
   ·培养基和试剂第78页
 2 方法第78-83页
   ·引物设计和基因扩增第78-79页
   ·酸性蛋白酶基因APG 表面展示流程第79-80页
   ·质粒构建图流程第80页
   ·大肠杆菌转化第80-81页
   ·阳性克隆的筛选第81页
   ·质粒提取第81页
   ·将带有酸性蛋白酶基因APG 的线性片段转入酵母Y. lipolytica P01h第81页
   ·酸性蛋白酶表面展示菌株的筛选第81页
   ·免疫荧光反应第81-82页
   ·利用表面展示的酵母细胞进行牛奶凝固实验第82-83页
 3 结果与分析第83-91页
   ·PMD19- T -APG 重组质粒构建第83页
   ·pINA1317-YCWP110-APG 表达质粒的构建第83-84页
   ·pINA1317-YlCWP110-APG 表达质粒的线性化第84-85页
   ·含酸性蛋白酶基因APG 的质粒片段转化Y.lipolytica P01h 和转化子的筛选第85-86页
   ·免疫荧光反应第86-87页
   ·表面展示细胞的牛奶凝固实验第87-91页
 本章小结第91-92页
第四章 酸性蛋白酶基因在高蛋白酵母菌 Y. lipolytica 22a-2 中高效表达及其在牛奶凝固中的应用第92-109页
 0 前言第92-93页
 第一节 高蛋白解脂耶罗维亚酵母菌22a-2 酸性蛋白酶AXP 基因克隆第93-95页
  1 材料第93页
   ·菌株和质粒第93页
   ·培养基和试剂第93页
  2 方法第93-94页
   ·Y. lipolytica 22a-2 基因组DNA 的提取第93页
   ·引物设计第93页
   ·PCR 扩增第93-94页
   ·PCR 产物回收第94页
   ·测序第94页
  3 结果和分析第94-95页
   ·AXP 基因的扩增第94-95页
   ·测序和比对第95页
 第二节 高蛋白酵母菌 Y. lipolytica 22a-2 酸性蛋白酶 AXP 基因敲除第95-105页
  1 材料第95-96页
   ·菌株和质粒第95-96页
   ·培养基第96页
  2 方法第96-99页
   ·敲除质粒的构建第96-98页
   ·酸性蛋白酶AXP 基因的敲除第98页
   ·敲除片段中URA3 基因的删除第98-99页
  3 结果和分析第99-105页
   ·AXP 基因上游同源序列、下游同源序列以及URA3 基因的扩增第99-100页
   ·3 个片段的连接和扩增第100页
   ·敲除片段的测序和比对第100-102页
   ·敲除片段转化Y. lipolytica 22a-2 和转化子的筛选第102-103页
   ·URA3 基因的删除第103-105页
 第三节 扣囊复膜酵母 A11 菌株 APG 基因在酵母22a-2 敲除菌株T3-13-10 中的表达第105-108页
  1 材料第105页
  2 方法第105-106页
   ·酸性蛋白酶活力的测定第105页
   ·牛奶-PPB 平板上透明圈的比较第105-106页
   ·菌体细胞干重和菌体蛋白含量的比较第106页
  3 结果和分析第106-108页
 本章小结第108-109页
第五章 重组酸性蛋白酶凝固牛奶机理的初步研究第109-115页
 0 前言第109页
 1. 菌株第109-110页
 2 方法第110页
   ·菌株43 重组酸性蛋白酶的纯化第110页
   ·纯化的重组酸性蛋白酶牛奶凝聚实验第110页
   ·纯化的重组酸性蛋白酶凝固牛奶机理的研究第110页
 3 结果和分析第110-114页
   ·重组菌株43 酸性蛋白酶的纯化第110-112页
   ·纯化的蛋白酶用于牛奶凝固实验第112页
   ·反应产物电泳分析第112-114页
 本章小结第114-115页
本论文总结和创新点第115-117页
攻读博士期间发表论文情况第117-118页
参考文献第118-142页
附录:英文缩写符号中英文名称对照表第142-144页
个人简介第144-145页
致谢第145页

 
 
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