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聚酰胺吸附铝离子显色法测定乌药叶中总黄酮的含量
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【免费西医学论文】【摘要】 目的采用聚酰胺吸附-铝离子显色法测定乌药叶中总黄酮的含量。方法经聚酰胺吸附后的样品，以芦丁为对照品，在420 nm处测定吸收波长，绘制标准曲线，确定浓度。结果总黄酮在0.002～0.10 mg·ml-1范围内呈良好的线性关系（r=0.999 5）。该法的平均加样回收率为97.5%,RSD为2.76%(n=5)。结论该方法简单、可靠。
【关键词】 乌药； 总黄酮； 聚酰胺； 紫外分光光度法
乌药Lindera aggregate（Sims）Kosterm.，樟科Lauraceae山胡椒属（Lindera）药用植物。《中国药典》（2005版）规定其块根入药，具有顺气止痛、温肾散寒等功效，临床上被广泛用于治疗寒凝气滞所致脘腹疼痛，中成药配伍广泛。据报道乌药叶中黄酮资源丰富，为乌药叶中抗菌、抗炎的主要成分［1,2］。关于应用紫外-可见光分光光度法测定其他植物中总黄酮的含量已有相关报道［3～6］，具有操作简单、数据可靠等优点；但是关于用分光光度法分析乌药叶中总黄酮的含量尚未见相关的报道。为更好地开发利用乌药叶资源，本文建立了聚酰胺吸附－铝离子显色法，对乌药叶中总黄酮的含量进行了测定。
1 仪器与材料
1.1 仪器UV2401PC型紫外分光光度计（日本岛津公司）；RE52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；FA2004A型电子天平（上海精天电子仪器有限公司）；SB80超声波清洗机（宁波江南药厂）。
1.2 试剂无水乙醇、甲醇（分析级AR，宜兴市展望化工试剂厂），石油醚（沸程60～90℃，上海试剂二厂）；聚酰胺（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；AlCl3·6H2O（分析级AR，国药集团化学试剂有限公司）；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号0080-9705）。
1.3 样品乌药样地设在浙江省天台县三州乡。200610在样地随机选取植株，用湿布包裹，塑料袋封装，立即带回实验室。将材料洗净，自然风干，70℃下干燥12 h，研磨后过金属网筛，将烘干样品放入到干燥器中保存，备用。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备精密称取芦丁标准品0.025 g，置于25 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得浓度为1.0 mg/ml的芦丁标准溶液。
2.2 供试品溶液的制备精密称取乌药叶粉末1.0 g，置250 ml三颈烧瓶中，用50%乙醇水浴加热（85℃）回流3次，每次溶剂100 ml，回流时间1 h，合并提取液，减压蒸馏除去溶剂，用甲醇溶解残渣并定容至50 ml。然后，加入10 ml水，用石油醚（60～90℃）萃取3次，每次用量为30 ml。萃取液经减压蒸馏除去甲醇后，过聚酰胺柱，用95%乙醇洗脱至无黄酮类物质为止。洗脱液减压浓缩，除去溶剂，残渣用甲醇溶解并定容至25 ml，备用。
2.3 测定波长的确定精密移取1 ml供试品溶液于10 ml容量瓶中，加入4 ml 1%氯化铝甲醇溶液，然后用甲醇定容至10 ml。同法，制得空白，在200～600 nm进行扫描，记录紫外吸收光谱，见图1。
从图1可以看出供试品溶液在225，275 nm和420 nm有吸收峰。由于420 nm干扰较小，因此确定检测波长为420 nm。
2.4 显色时间的确定精密移取1 ml供试品溶液于10 ml容量瓶中，加入4 ml 1%氯化铝甲醇溶液，然后用甲醇定容至10 ml。每隔1 min于420 nm处测定其吸光度。 结果表明，供试品溶液显色15 min后，吸光度几乎维持稳定。
图1 样品的紫外吸收光谱图（略）
2.5 聚酰胺用量的考察取适量聚酰胺粉末用95%乙醇煮沸30 min后抽滤，如此重复3次。将最后抽干的粉末先置于室温下自然干燥30 min，然后放入烘箱70℃下干燥1 h。
分别称取0.15，0.30，0.45，0.60，0.90 g聚酰胺粉，以95%乙醇作流动相，装入层析柱中，加入黄酮提取液，以10～15倍95%乙醇洗脱，采用铝离子显色反应检测出口流出液。将流出液浓缩用甲醇定容至50 ml，用紫外测定其吸光值变化。结果表明当聚酰胺用量超过0.45 g之后，吸光度变化不大。
2.6 标准曲线的绘制精密量取芦丁对照品溶液0.2，0.5，1.0，5.0，10 ml置于10 ml容量瓶中，甲醇定容。分别移取1 ml溶液，分别置于10 ml容量瓶中，加入4 ml 1%的氯化铝－甲醇溶液，用甲醇定容至刻度线，摇匀，放置15 min。同法制得空白液，按分光光度法，在420 nm波长处测吸光值。以吸光值为纵坐标，对照品溶液得浓度为横坐标，绘制曲线，进行线性回归。得回归方程为：A＝7.059 2C－0.006 6，相关系数r＝0.999 5。结果表明，芦丁对照品在所试浓度0.002～0.10 mg/ml内呈良好的线性关系。
2.7 重复性实验取同一供试品溶液按上述方法连续检测6次，RSD＝0.24%，可见该方法重复性好，精密度高。
2.8 回收率实验采用加样回收率法，取供试品溶液0.10 ml 5份，分别添加已知含量的芦丁对照品溶液，测定总黄酮量，平均加样回收率为97.5%，RSD＝2.76%（n＝5）。
2.9 样品测定取供试品溶液于420 nm处测定吸光值，计算供试品含量为2.10%。
3 结论
黄酮类化合物为乌药叶抗菌、抗炎的主要有效成分，本研究建立总黄酮含量的分析方法，样品经提取、聚酰胺吸附、三氯化铝络合后，采用分光光度法，在420 nm处，以芦丁为对照品测定其含量。本研究并进行了重复性、回收率实验，证明方法简便可靠，为以后深入开展乌药叶资源的研究奠定了基础。
【参考文献】
［1］ 张朝凤, 孙启时, 赵燕燕, 等. 乌药叶中黄酮类成分研究［J］.中国药物化学杂志，2001，11(5)：274.
［2］ 张朝凤, 孙启时,桂新，等. 乌药叶中黄酮类成分研究（2）［J］.沈阳药科大学学报，2003，20(5)：342.
［3］ 闫永红, 王文全, 杨 娜. 栽培甘草中总黄酮的含量测定［J］.中国中药杂志，2006，31(12)：1019.
［4］ 黄林芳, 万德光. 川产苦丁茶中总黄酮德含量测定［J］.时珍国医国药，2004，15(6)：327.
［5］ 蔡 健, 王 薇. 黄瓜叶总黄酮含量的研究［J］.食品科学, 2005, 26(8)：194.
［6］ 秦孟根, 舒 伟. 刺梨总黄酮的含量测定［J］.中草药, 1999, 30(2)：106.
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