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蔬菜中拟除虫菊酯残留ELISA快速检测试剂盒的研制
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【西医学免费毕业论文下载】拟除虫菊酯是一类人工合成的杀虫剂，包括醚菊酯、苄氯菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯等20种农药，因其杀虫谱广且效果好而被广泛用于防治农业害虫，在蔬菜、果树害虫防治等方面取得了较好的效果。目前，?M除虫菊酯类农药已成为我国使用量最大的农药种类之一，但是由于使用面
拟除虫菊酯是一类人工合成的杀虫剂，包括醚菊酯、苄氯菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯等20种农药，因其杀虫谱广且效果好而被广泛用于防治农业害虫，在蔬菜、果树害虫防治等方面取得了较好的效果。目前，?M除虫菊酯类农药已成为我国使用量最大的农药种类之一，但是由于使用面积大、应用范围广、接触人群多、生物毒性强、高残留且具有富集性及难以降解等特殊性质，拟除虫菊酯农药残留也已成为一种严重的环境污染问题，因其导致的中毒现象屡有发生，尤其是谷物、水果、蔬菜等食品中残留的低浓度农药进入人体所造成的慢性和亚慢性毒性问题。我国强制性国家标准GB 2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中明确规定了拟除虫菊酯类各种农药的残留限量要求，其中蔬菜中的MRL低至0.5mg/kg；欧盟也将拟除虫菊酯类农药定为农产品中不得检出的农药品种。随着我国国际化进程的不断加快，国内的检测标准和方法灵敏度呈现出越来越严格的趋势，这意味着对国内检测方法的技术水平和便捷性提出了更高的要求。
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目前，对拟除虫菊酯残留的检测主要为仪器检测法，包括气相色谱-电子捕获法（Gas Chromatography- Electron Capture DetectorGas，GC-ECD）、气相色谱-质谱法（Gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）等。尽管这些方法灵敏度较高，但样品的前处理步骤较多，相对费时且检测费用较高，不适用于大量样品的检测。
酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）作为一种基于抗原抗体反应和酶化学反应的检测方法，具有特异性强、样品容量大、样品前处理简单和分析成本低等特点，在大量样本和现场样本快速筛选检测中显现出明显优势。目前已有学者初步研究了ELISA技术用于拟除虫菊酯类药物检测，文孟棠等人研究了大白菜中拟除虫菊酯类农药半定量ELISA检测方法，优化了抗原抗体反应时间，但是对63个大白菜样本检测假阳性率达9.3%，假阴性率达2.7%，样本少且误判率较高，不利于实际应用；骆爱兰、余向阳等人研究了甲氰菊酷、氯氰菊醋、三氟氯氰菊酷、澳氰菊醋4种农药的ELISA同时检测，但是检出限仅能达到217.2μg/kg，且假阳性率为4.72%，检测水平有待提高；郝晓蕾利用间接ELISA方法研究了氰基拟除虫菊酯的快速检测，但是灵敏度不高，检测指标有限。由此看来，目前关于酶联免疫吸附法用于拟除虫菊酯类药物检测的文献报道较为匮乏，多种农药残留同时检测技术、相关产品研制与应用均存在巨大潜力。
本研究通过自主研发人工抗原及多克隆抗体，建立了蔬菜中拟除虫菊酯类农药残留ELISA快速检测方法，用于氯氰菊酯、甲氰菊酯、顺式氰戊、氰戊菊酯、溴氰菊酯等多种药物的同时检测，探讨了拟除虫菊酯酶联免疫试剂盒的各项检测性能，以达到保障农产品质量安全，提升菊酯类药物快速检测技术的目的。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蔬菜样本均购买于北京大型超市；拟除虫菊酯类农药标准品（中国药品生物制品检定所）；去离子水、浓缩洗涤液（磷酸缓冲液）（北京维德维康生物技术有限公司）。
1.2 仪器与设备
酶标仪（MK3型，美国Thermo）；离心机（TDL-40C型，上海安亭科学仪器厂）；涡动仪（HQ-60型，北京方正生物科技发展有限公司）；超纯水仪（Milli-Q Academic A10型号，美国Milli-Q公司）；氮吹仪（N-EVAP型，美国Organomation公司）等。
1.3 方法
1.3.1 半抗原制备
半抗原结构一的合成：称取500mg化合物1于50mL三口瓶中，加入10mL DMF溶解，加入160mg NaH（6.7mmoL）冰浴反应30min，加入琥珀酸酐室温反应4h；石油醚∶乙酸乙酯=6∶1，点板化合物1反应完后，加水和乙酸乙酯萃取3次，将有机相合并后用无水硫酸钠干燥半小时，浓缩，得到的物质即为半抗原结构一。
半抗原结构二的合成：称取500mg化合物1于50mL三口瓶中，加入10mL N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）溶解，加入160mg NaH（6.7mmoL）冰浴反应30min，加入邻苯二甲酸酐室温反应4h；石油醚∶乙酸乙酯=6∶1，点板化合物1反应完后，加水和乙酸乙酯萃取3次，将有机相合并后用无水硫酸钠干燥半小时，浓缩，得到的物质即为半抗原结构二。
1.3.2 人工抗原的制备
免疫原制备：将14.52mg半抗原结构一用1.5mL DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入1-（3-二甲基胺丙基）-3-乙基碳二亚胺（1-（3-dimethylaminopropyl）3-ethylcarbodiimide，EDC）225.7mg，溶解后再加入NHS 20.3mg，室温搅拌活化2～3h。称取牛血清白蛋白50mg溶于3.5mL 0.1M碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温（0～4℃），1000rpm搅拌下，将步骤1反应液逐滴加入，500rpm搅拌反应24h。将反应产物装入蒸馏水冲洗干净透析袋（10cm），1L 0.01M PBS（1×，pH7.2）4℃搅拌（100rpm）透析3d，将透析产物5000rpm离心6min，将抗原编号，于-20℃下保存备用。
包被原制备：将24.8mg半抗原结构二用1.5mL DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入EDC 38.35mg溶解后再加入NHS 23mg，室温搅拌（500rpm）活化2～3h。称取卵清蛋白50mg溶于3.5mL 0.1moL/L碳酸氢钠溶液中，200rpm搅拌10min，使其充分溶解，冰浴降温至0～4℃，1000rpm下搅拌，逐滴加入（1mL/min）步骤1的反应液，500rpm搅拌反应24h。将反应产物装入用蒸馏水冲洗干净的透析袋（10cm），加入1L 0.01M PBS（1×，pH7.2），4℃搅拌（100rpm）透析3d，每天换液3次，将透析产物5000rpm离心6min，将抗原编号，于-20℃保存备用。 1.3.3 抗体制备与纯化
以研发的人工抗原新西兰雌性大白兔为研究对象，采用背部皮下多点注射的方式进行免疫。首次用弗氏完全佐剂乳化人工抗原免疫，间隔一定时间后进行加强免疫（佐剂为IFA）。每种抗原的免疫剂量是每只兔子1000μg，免疫间隔3周，收集得到的多抗血清用蛋白A亲和柱进行纯化，冻干后于-20℃环境下保存。
1.3.4 ELISA方法的建立
取1.0±0.01g均质后的蔬菜样品于50mL离心管中，加入5mL甲醇，充分涡动1min；4000rpm离心5min；取100μL上清液于新的离心管中，加入400μL样品稀释液，充分涡动30s；用于后续检测。
用包被缓冲液稀释包被抗原，每孔加入100μL，37℃温育2h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次30s，拍干；在每孔中加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去封闭液，用洗涤液洗涤4次，每次30s，拍干；依次将50μL各标准品工作液/样品溶液、80μL酶标抗体工作液加入对应的标准品/样本孔中，盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下（25±2℃）避光反应40min；洗涤4次，拍干；立即在每孔中加入100μL A、B混合液；盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下（25±2℃），避光反应10～15min；揭开盖板膜，在每孔中加入50μL终止液，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀；5min内用酶标仪在双波长450nm、630nm下读取酶标板吸光度值。
1.3.5 建立标准曲线
在空白标准溶液中加入拟除虫菊酯（氯氰菊酯、甲氰菊酯、顺式氰戊、氰戊菊酯、溴氰菊酯），使标准品达到一系列浓度（0、0.03、0.09、0.27、0.81、2.43μg/L），根据实验数据绘制标准曲线，并计算拟除虫菊酯的半抑制浓度（IC50）。
1.3.6 试剂盒性能验证
为了评价该分析方法和测量系统的准确性，采用空白样品（不含拟除虫菊酯类农残）进行添加回收实验，分别考察ELISA技术的检出限、准确度、精密度以及特异性。
检出限：分别测定20份小白菜、油菜、菠菜、圆白菜等蔬菜样本，取其测定平均值加上3倍标准差（SD）即为本方法的检出限。
特异性?验：选取氯氰菊酯、甲氰菊酯、顺式氰戊、氰戊菊酯、联苯菊酯、溴氰菊酯、乐果、对硫磷等常见农药，计算各自的IC50，并按照下式计算交叉反应率―交叉反应率（CR%）=IC50（氯氰菊酯）/IC50（结构类似物）×100%。
准确度验证：取空白小白菜、油菜、菠菜、圆白菜样本分别添加5.0μg/L、10.0μg/L氯氰菊酯，6.0μg/L、15.0μg/L甲氰菊酯、溴氰菊酯，15.0μg/L、30.0μg/L顺式氰戊，7.0μg/L、15.0μg/L氰戊菊酯，每个样本进行5次平行试验，并检测，记录检测结果，计算回收率。
精密度验证：随机抽取3批次酶标板进行检测，每个试验重复5次，分别计算批内、批间变异系数。
仪器确证试验：利用本研究开发的拟除虫菊酯试剂盒和气相色谱-质谱（GC-MS）分别对20个蔬菜样本进行检测，比对检测结果，确定该检测方法的准确性。
2 结果与分析
2.1 建立标准曲线
通过对抗原抗体制备，优化反应条件（抗原抗体浓度、包被方式、加样体系、反应时间等），选择IC50最低值作为最佳工作条件，此时灵敏度最高。标准曲线如图所示，横坐标为标准品溶液的浓度值（μg/L），纵坐标为不同浓度标准品的结合率（B/B0×100%），计算得R2=0.995；IC50=0.47μg/L；标准曲线的线性范围为：0.08～0.81μg/L。
2.2 交叉反应率
本研究所用的拟除虫菊酯多克隆抗体与其它农药的交叉反应率情况见表1，所研制的多克隆抗体可以实现氯氰菊酯、甲氰菊酯、顺式氰戊、氰戊菊酯、溴氰菊酯5种菊酯类药物的同时检测，并与其它药物交叉反应率小于0.1，说明抗体特异性强，与其他药物无交叉，检测指标全面，可以实现5种菊酯药物的特异性检测。
2.3 试剂盒性能验证
2.3.1 检出限验证
分别对20份小白菜、油菜、菠菜、圆白菜等蔬菜空白样本进行检测，结果如表2所示，本试剂盒对小白菜、油菜、菠菜、圆白菜中拟除虫菊酯的检出限（LOD）分别为4.95μg/L、4.64μg/L、4.18μg/L、3.57μg/L，为保障试剂盒检测结果的准确和稳定，设置本试剂盒的检出限为5.0μg/L。由各项药物的交叉反应率（如表1）可知，试剂盒对氯氰菊酯的检出限约为5.0μg/L，对甲氰菊酯的检出限约为6.0μg/L、顺式氰戊的检出限约为15.0μg/L、氰戊菊酯的检出限约为7.0μg/L、溴氰菊酯的检出限约为6.0μg/L。
2.3.2 ELISA方法的准确度、精密度验证
通过添加药物标准溶液计算试剂盒的回收率和批内、批间变异系数，来评价试剂盒的准确度和精密度。由表3可知，各种蔬菜样本的添加回收率范围为65.5%～109.6%；批内、批间变异系数均小于5%，说明所研制的拟除虫菊酯酶联免疫试剂盒具有良好的回收率，准确度较高，精密度达到了行业对于ELISA试剂盒要求的技术水平。
2.3.3 仪器确证试验
从超市购买小白菜、菠菜、油菜、圆白菜样本各20份，分别用拟除虫菊酯试剂盒（检出限为5.0g/L）和气相色谱-质谱（检出限为2.0g/L）进行检测，低于检出限用“0.05），由此可见，两种方法的检测结果无显著性差异。通过对比发现，本研究研制的拟除虫菊酯ELISA试剂盒达到了与仪器确证方法相同的检测水平，能准确检测蔬菜中拟除虫菊酯的残留，同时，ELISA方法操作便捷，节约了大量时间，能够大幅度降低检测成本。
3 结论
目前，关于拟除虫菊酯快速检测方法的研究报道较少，使用常规仪器的检测方法操作繁琐，耗时长。本研究通过人工合成抗原，突破性地建立了“一步法”酶联免疫方法，并研制了相应的酶联免疫试剂盒来实现蔬菜中拟除虫菊酯药物残留的快速检测。此方法具有以下优点：
①所研制的多残留试剂盒检出限可低至5.0μg/L，与骆爱兰、余向阳、孙宁浩、张婧等人的单一药物残留检测方法检出限（分别为217.2g/L、0.2 mg/L、0.01～0.02mg/kg）相比灵敏度有显著提高。
②半抗原合成路线简洁，仅两步反应即可完成抗原制备，最大限度的保留了药物的公共部分，充分增加了交叉药物种类，检测指标覆盖氯氰菊酯、甲氰菊酯、顺式氰戊、氰戊菊酯、溴氰菊酯5种拟除虫菊酯药物，与刘景坤、李志茹、胡久平、文孟棠等人的单一药物检测报道相比，药物覆盖全面，交叉反应率分布平均，更具广谱性。
③本研究开发了“一步法”酶联免疫方法，样本前处理简单，检测过程操作步骤简洁，可在1h内实现样本检测，能够有效降低检测成本。
④通过验证所研制酶联免疫试剂盒的检出限、准确度、精密度，各项指标均符合我国残留检测标准的规定，并且通过实际样本检测也进一步证实了本方法的实用性。
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