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小麦种子萌发早期淀粉降解关键酶活性及基因的运作效果
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【林业毕业论文】摘要：为研究小麦种子萌发早期淀粉降解关键酶活性及其基因表达量变化，以山农17为试验材料，测定了不同温度条件下萌发的小麦种子中的淀粉、可溶性糖含量及相关酶（淀粉酶和淀粉磷酸化酶）活性，并采用实时荧光定量PCR技术测定各酶相关基因相对表达量。结果显示，不同温
摘要：为研究小麦种子萌发早期淀粉降解关键酶活性及其基因表达量变化，以山农17为试验材料，测定了不同温度条件下萌发的小麦种子中的淀粉、可溶性糖含量及相关酶（淀粉酶和淀粉磷酸化酶）活性，并采用实时荧光定量PCR技术测定各酶相关基因相对表达量。结果显示，不同温度条件下萌发的小麦种子，淀粉含量随萌发进程以不同的速率呈下降趋势，可溶性糖含量呈先下降后上升趋势，α-淀粉酶、淀粉磷酸化酶活性和呼吸速率整体呈上升趋势，以上各指标均在露白前后有明显的变化；β-淀粉酶呈现双峰变化趋势，且一直保持较高活性；α-淀粉酶和淀粉磷酸化酶基因的相对表达量均呈上升趋势，且与酶活性呈极显著相关。以上结果表明，在小麦种子萌发早期，温度能强烈影响萌发过程中淀粉降解关键酶基因的表达量；α-淀粉酶和淀粉磷酸化酶在种子置床初期即可被检测到活性，且受其编码基因的调控作用显著，在种子萌发过程中具有重要作用。
关键词：淀粉代谢； 淀粉酶； 淀粉磷酸化酶； 荧光定量PCR； 基因表达
中图分类号：S512.1+1文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）09-0039-07
萌发是植物生长发育的前提，关系到作物后续生长，乃至最终产量[1]。影响种子正常萌发的因素很多，包括内部生理条件和外部环境条件，其中，温度强烈影响萌发种子内部酶活性和物质代谢，进而影响发芽率和萌发速率[2]。
目前，对种子萌发代谢的研究已从传统的生理生化水平深入到基因组及蛋白质组水平[3]。但诸类深层次的研究大多集中于大麦、番茄以及模式植物拟南芥，且主要针对种子萌发后期的代谢变化，对萌发初期的研究甚少[4，5]。Weitbrecht等[6]指出对种子萌发早期（介于干燥种子和胚突破种皮后幼苗建成阶段之间）内部代谢事件进行研究，对于完善种子萌发的机理具有重要意义。
淀粉降解是小麦种子萌发过程中主要的物质代谢，其代谢产物为种子萌发提供必需的养料和能量[7]。关于淀粉降解及其相关酶的研究已有诸多报道[8]。然而，在基因水平层面的研究多集中在种子发育过程中的淀粉合成部分[9，10]，对萌发过程中淀粉降解关键酶基因表达量的研究不多。因此，本研究以当地小麦品种山农17为试验材料，测定了不同温度条件下萌发早期（介于干燥种子和胚突破种皮后幼苗建成阶段之间）淀粉和可溶性糖含量、淀粉降解关键酶活性及其基因相对表达量变化，旨在探究种子萌发早期淀粉降解的酶学变化和基因转录调节变化，以期为进一步阐明小麦种子萌发机理提供基础数据。
1材料与方法
1.1材料与设计
以小麦品种山农17为试验材料，2012年收获于山东农业大学试验站。
发芽共设置3个温度处理（最适温度20℃、高温30℃、低温10℃）。取样时间分布在萌发前、露白至发芽三个阶段。具体取样时间：30℃下萌发的种子每隔4 h取样；20℃和10℃条件下萌发的种子每隔8 h取样，直到发芽结束（胚芽长度为种子一半）时停止取样。此外，20℃和10℃条件下，在露白时各增加一次取样（20℃、12 h，10℃、40 h）。发芽前将种子含水量调整到12.5%（以减少种子本身对结果造成的差异），用5%H2O2消毒2～3 min，再用去离子水冲洗5～6遍后选取100粒籽粒饱满、大小均一的种子，整齐的摆放到发芽盒，放入培养箱培养，每天适量补水并按时取样。重复3次。用于RNA提取的材料保存于液氮中，用于酶活性测定的材料液氮速冻后放入-20℃冰箱中备用
1.2试验方法
1.2.1测定方法淀粉含量参考双波长法测定[11]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定[12]；α-淀粉酶、β-淀粉酶及总淀粉酶活性参考3，5-二硝基水杨酸法测定[13]；淀粉磷酸化酶活性采用无机磷释放定量分析法测定[14]。
1.2.2小麦籽粒总RNA的提取、质量检测及反转录总RNA的提取、质量检测参考李浩等的方法[15]。cDNA合成按照宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）反转录试剂盒说明书进行，反转录后的cDNA保存于-20℃冰箱备用。
1.2.3荧光定量PCR用于目标基因表达分析的引物序列（表1）来源于参考文献或利用Primer 6软件设计，通过NCBI进行Blast同源比对后由上海生工生物工程有限公司合成。各酶基因表达量分析采用实时荧光定量PCR，反应采用宝生物试剂盒（SYBR Premix Ex TaqTM），反应体系为20 μL。
2结果与分析
2.1总RNA纯度及完整性检测
经琼脂糖凝胶电泳检测（图1），加样孔中无明显亮带，表明无蛋白质污染。总RNA的28S rRNA和18S rRNA条带清晰，且条带亮度比约为2∶1，5S条带较弱，说明总RNA的完整性较好，无明显降解。
2.2荧光定量PCR引物的特异性
荧光定量PCR的扩增曲线符合“S”形荧光增长曲线（图2），目的基因及内参基因扩增的动力学曲线平行性较好，曲线拐点清楚。熔解曲线集中，只有1个明显峰，目的基因与内参基因扩增产物的Tm值均一，表明在实时荧光定量PCR过程中，各基因扩增产物具有特异性，无非特异性扩增及引物二聚体出现。
2.3种子萌发过程中淀粉及可溶性糖含量的变化
2.3.1淀粉含量变化由图3A、B、C可知，不同萌发温度条件下两种类型淀粉及总淀粉含量均逐渐下降，总体趋势相似，萌发温度越高，下降速率越大，且均在露白（箭头标出）时表现出较大幅度下降。但不同温度下种子消耗淀粉的总量不同，表现为10℃>30℃>20℃，说明温度过高或过低均要消耗较多的淀粉。各类型淀粉的总变化量也不同，直链淀粉下降总量表现为30℃>10℃>20℃，支链淀粉则表现为10℃>20℃>30℃，说明较高温度下直链淀粉消耗较多，低温条件下支链淀粉较易分解。露白时，20℃和30℃下萌发的种子直链淀粉含量相差不大，均高于10℃下萌发的种子直链淀粉含量，支链淀粉和总淀粉呈相同的规律。
2.3.2可溶性糖含量变化由图3D可知，不同温度下萌发的小麦种子可溶性糖均呈现先降低后升高趋势，趋势改变的转折点均在露白处。总体来看，从置床到种子萌发结束，不同温度条件下萌发的小麦种子，其可溶性糖含量变化幅度相差不大，即可溶性糖的最低含量稍高者，其最高含量也稍高些。种子可溶性糖含量在下降过程中表现为萌发温度越高，含量下降越快；在上升过程中则表现为萌发温度越高，含量上升越快。露白时，10℃和20℃下萌发的种子中可溶性糖含量相差不大，均略低于
30℃下萌发的种子。这与萌发温度越高，种子内部的代谢越活跃有关。 2.4种子萌发过程中呼吸速率的变化 种子萌发过程呼吸作用的底物为淀粉降解的一些可溶性糖类，因此，萌发过程中呼吸速率可在一定程度上反映淀粉代谢
30℃下萌发的种子。这与萌发温度越高，种子内部的代谢越活跃有关。
2.4种子萌发过程中呼吸速率的变化
种子萌发过程呼吸作用的底物为淀粉降解的一些可溶性糖类，因此，萌发过程中呼吸速率可在一定程度上反映淀粉代谢强度。由图4可知，不
同温度条件下萌发的种子，其呼吸速率总体均呈上升趋势。但不同萌发温度条件下的种子在相同萌发时间表现为萌发温度越高，种子呼吸作用越强，且整体变化幅度越大，上升速率越快，即30℃>20℃>10℃。呼吸速率在种子露白前一时期就已呈现明显变化，比淀粉及可溶性糖含量明显变化的时间点早一个时期，说明呼吸作用加速
了淀粉的降解。到种子露白时，不同萌发温度条件下种子的呼吸速率相差不大，但到萌发结束时，各萌发温度下的种子呼吸速率差别增大，30℃下的与20℃差异要明显小于20℃与10℃的差异，说明低温条件严重影响种子的呼吸速率及能量代谢，进而延长种子萌发完成所需要的时间。
2.5种子萌发过程中淀粉降解酶的活性变化
2.5.1α-淀粉酶活性由图5A可知，不同温度条件下萌发的种子α-淀粉酶活性均呈上升趋势，且在露白处出现明显上升。在萌发结束时，除30℃条件下萌发的种子淀粉酶活性略有降低外，其它温度条件下均有趋于稳定的趋势。不同温度下，在相同萌发时间α-淀粉酶活性表现出温度越高，酶活性越高的规律，即30℃>20℃>10℃，种子露白时不同温度条件下α-淀粉酶活性表现为10℃>30℃>20℃，但到发芽结束时酶活性差异不大。
2.5.2β-淀粉酶活性由图5B可知，β-淀粉酶活性在不同温度条件下随萌发进程整体呈现不同的变化趋势，其中，20℃下萌发的种子呈先上升后下降的单峰变化，而10℃和30℃条件下的种子
则呈上升下降后又上升下降的双峰变化趋势。种子露白时，萌发温度越高β-淀粉酶活性越大，但不同温度条件下的最大峰值相差不大，且均在露白后出现。种子萌发结束时，β-淀粉酶活性下降至最低点。整个萌发过程（包括干种子）中β-淀粉酶都具有较高的活力，这可能与种子中预存无活性的β-淀粉酶聚合体有关。
2.5.3淀粉磷酸化酶活性由图6可知，淀粉磷酸化酶活性随种子萌发进程逐渐上升，且均在露白时出现明显上升。不同温度条件下，淀粉磷酸化酶活性在相同萌发时间表现出温度越高、酶活性越高的规律，即30℃>20℃>10℃。但在种子露白及萌发结束时，不同温度条件下萌发的种子酶活性相差不大，且除20℃条件下萌发的种子以外，其它条件下萌发的种子酶活性趋于稳定，说明淀粉磷酸化酶在整个萌发早期具有重要作用，到萌发结束时酶作用可能已达到最大值。
2.6不同淀粉降解酶基因的相对表达量变化
2.6.1α-淀粉酶基因α-Amy1-2表达量由图7A可以看出，不同温度条件下α-淀粉酶基因α-Amy1-2相对表达量不同，10℃和20℃条件下，基因表达量整体呈上升趋势，且均在露白处明显上升，接近发芽结束时趋于稳定表达；30℃条件下，基因表达量先上升，置床至20 h后又有所下降。不同萌发温度条件下，该基因在露白和发芽结束时相对表达量表现出温度越低，上调越明显，即10℃>20>30℃，但发芽结束时相对表达量的差距比露白时增大，尤其10℃下萌发的种子基因表达量上调幅度很大。此外，经相关性分析发现，α-淀粉酶基因表达量与酶活性变化具有极显著的相关性，相关系数为0.84，说明该基因对酶活性的调控具有重要的作用。
2.6.2β-淀粉酶基因β-Amy表达量由图7B可以看出，不同温度条件下该基因表达量总体变化趋势不同。30℃和10℃条件下萌发的种子，β-Amy基因表达量均呈现先上升后下降、再上升又下降的双峰趋势，且第一次的峰值及最低点均出现在露白前，第二个峰值出现在露白后不久，之后表达量逐渐下降，至萌发结束时低于未萌发时的表达量。20℃条件下萌发的种子基因表达量呈先上升后下降的单峰形式，但在露白前有一缓慢上升阶段，最高峰出现在露白后4 h，之后表达量逐渐下降至萌发结束时低于未萌发时的表达量，这说明β-Amy基因主要在种子露白结束后的一个时期之前明显表达。虽然不同温度条件下基因的表达量总体变化趋势不同，但在种子露白及萌发结束时，基因表达量相差不大。此外，经相关性分析发现，该基因的表达量与β-淀粉酶活性变化没有明显的相关性，但是两者变化曲线趋势相似，只是在时间进程上有所差别。
2.6.3淀粉磷酸化酶基因SP-cyt/Pho-H表达量由图8可知，不同温度条件下萌发的小麦
种子在萌发早期，其SP-cyt/Pho-H型淀粉磷酸化酶基因表达量随种子萌发进程整体均呈上升趋势，且在露白处出现明显上升；但萌发温度越高，在相同萌发时间基因表达量越高，即30℃>20℃>10℃。30℃条件下萌发的种子到最后两个时期基因表达量上升缓慢；10℃条件下在萌发结束时略有下降，但仍高于最初种子未置床时的表达量；20℃条件下则在发芽前8 h时表达量出现下降，后又迅速上升。到萌发结束时，30℃和10℃条件下该基因表达量相差不大，但均小于20℃下基因表达量。此外，经相关性分析发现，该基因表达量与淀粉磷酸化酶活性变化具有极显著的相关性，相关系数为0.93，说明该基因对酶活性的调控具有重要的作用。
3结论与讨论
温度能强烈影响酶活性、呼吸作用及物质转化等过程，从而影响种子萌发质量，在适宜的温度条件下种子才能既快又好的萌发。本试验结果显示，30℃、20℃和10℃条件下小麦种子萌发至结束所用时间分别为28、40、112 h，充分体现了温度对萌发进程的影响。
种子萌发过程中，可溶性糖由淀粉等高分子多糖降解产生，同时又作为呼吸底物被消耗，使得可溶性糖含量与淀粉降解速率和呼吸消耗速率有关，含量变化趋于复杂化。有研究表明，可溶性糖含量在种子萌发过程中处于动态平衡中[18]。本试验结果显示的变化趋势可能与萌发初期呼吸酶系统、淀粉降解酶系统活化顺序及细胞膜功能恢复状态有关。此外，较高的可溶性糖含量可增强种子抵御寒冷的能力[19]，这可能是萌发24 h内，10℃条件下萌发的种子其可溶性糖含量下降较慢的一个原因。
淀粉酶对淀粉的降解作用与萌发温度有较大关系，且与作物种子类型有关。Wijngaard等[20]对以荞麦为材料研究表明低温（16.5℃）下发芽时&alp
ha;-淀粉酶的活性最高。不同作物种子如水稻[21]干种子胚中具有较高的-淀粉酶活性。本试验结果显示，高温（30℃）条件下萌发的小麦种子其-淀粉酶的活性最高，整体呈逐渐上升的趋势。-淀粉酶在籽粒发育和成熟过程中形
ha;-淀粉酶的活性最高。不同作物种子如水稻[21]干种子胚中具有较高的α-淀粉酶活性。本试验结果显示，高温（30℃）条件下萌发的小麦种子其α-淀粉酶的活性最高，整体呈逐渐上升的趋势。β-淀粉酶在籽粒发育和成熟过程中形成，以无活性的聚合体形式贮藏于干种子中，在萌发时逐步释放激活[8]，这可能是本试验中β-淀粉酶在置床不久就表现出较高活性的原因。淀粉磷酸化酶既催化淀粉降解又参与淀粉合成，反应方向由底物相对浓度决定[22]。但在植物淀粉粒内，由于植物细胞中反应底物无机磷浓度比产物葡萄糖-1-磷酸几乎高了两个数量级，该酶主要负责淀粉降解，且酶活性随着萌发进程逐渐升高[23]，与本试验结果相同。此外本研究还发现，该酶活性随种子萌发温度上升而升高。
文迪[23]指出，在编码β-淀粉酶的两个同工酶基因[β-amylase和β-amylase （5amy）]中，β-amylase基因在籽粒中有表达，是籽粒β-淀粉酶的主要调控基因。本研究中β-Amy基因表达量变化与酶活性变化虽然无显著相关性，但两者变化规律相似，即酶活性变化均滞后于基因表达量变化一个时期左右，这说明该基因对β-淀粉酶活性具有一定的调控作用。Schupp等[24]指出质体型Pho-L基因在小麦种子萌发过程中表达量相当低，Pho-H型淀粉磷酸化酶蛋白存在于在萌发的小麦种子胚中，本研究结果表明，该酶基因表达量相对于未置床种子的上调幅度随萌发进程而增大。萌发结束时，萌发温度越低，基因表达量越高，而此时所对应的酶活性相差不大（这与本研究结果中α-淀粉酶基因与酶活性的关系相似），由此可以在转录水平上说明淀粉磷酸化酶对小麦种子萌发早期淀粉的降解具有重要作用。
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