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微波法快速提取丝状真菌基因组DNA

【药学专业毕业论文】作者:田永强 苏敏 赵洪林 邵洋 左炀 陈小林 何钊 刘立新 冯兴 赵子翰 褚以文【摘要】 丝状真菌基因组DNA的提取是一个费时、费力,并且费用较高的工作,效率较低。本文报道一种以微波热振破壁处理真菌菌丝,快速、简便和高效提取真菌基因组DNA的方法。以提取的DNA为模板可以扩增出18S rRNA基因。
【关键词】 微波法; 丝状真菌; 基因组DNA提取;
丝状真菌广泛存在于自然界中,在工农业生产中占据非常重要的地位[1]。丝状真菌资源的开发需要对大量的菌种进行快速筛选、鉴定和改良。分子技术的发展使对真菌进行快速和高效鉴定与改良成为现实,因此迅速、方便、实惠的真菌DNA提取就显得相当重要。真菌因为有不同于细菌的细胞壁,而且真菌中有较多的多糖成分影响到所提DNA的质量和后续的分析。平常的方法如提取放线菌、细菌的DNA方法不适合真菌基因组DNA的提取,而常用的酶法或液氮破壁的方法在实际操作中因为成本和储存条件的问题使其应用受到局限。许多学者对丝状真菌基因组DNA的提取方法进行了摸索和改进[2,3]。微波炉已成为实验室的常规设备之一,徐平等[4]用微波法提取放线菌DNA得到较好的结果。受此启发,我们把微波法应用到真菌基因组DNA提取中,找到一种新的提取丝状真菌基因组DNA的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
(1)菌种 见表1。
(2)试剂缓冲液为50mmol/L TrisHCl,pH7.7,25mmol/L EDTA,0.1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP);裂解液为50mmol/L TrisHCl,pH8.0,25mmol/L EDTA,3% SDS,1.2% PVP;抽提液为10mmol/L TrisHCl,pH8.0,1mmol/L EDTA,0.3mol/LNaAc,1.2% PVP;18S rRNA基因扩增引物为F181f(5′ACCTGGTTGATCCTGCCAG3′)和F182b(5′ATCCTTCCGCAGGTTCACC3′)由上海生工合成, 表1 实验菌株
编号菌 种 菌号1 Stachybotrys chlorohalonata SIIA 15072 Stachybotrys dichroa SIIA 15503 Aspergillus carbonarius SIIA 15844 Aspergillus wentii SIIA 15945 Aspergillus sp. SIIA 16386 Aspergillus sydowii SIIA 16327 Penicillium sp. SIIA 17098 Penicillium brevicompactum SIIA 17159 Penicillium brevicompactum SIIA 174610 Penicillium expansum SIIA 170811 Mariannaea sp. SIIA 1299712 Nectria mariannaeae SIIA 1236113 Gibberella fujikuroi SIIA 14231
SIIA:中国医药集团四川抗菌素工业研究所抗生素微生物
资源中心。
Taq酶购自北京天根公司。丝状真菌斜面培养选用PDA培养基,菌丝收集选用液体培养基,成分为:水解酪素0.05g,蔗糖1.5g,酒石酸铵0.5g,NH4NO3 0.1g,K2HPO4 0.1g,NaCl 0.01g,CaCl2 0.01g,H2O 100ml;pH自然。
1.2 方法
(1)菌体准备 将菌种接种于PDA斜面培养基上,26℃培养3d,挑菌于100ml液体培养基中,在220r/min的摇床上于26℃培养3~4d,离心收集菌体,用无菌蒸馏水洗涤菌丝3次,保存于-20℃冰箱。
(2)DNA提取 用无菌竹签挑取菌丝体1g加入研钵中, 加入300μl的缓冲液,并加入预先准备好的0.5g的酸洗石英砂,研磨至菌落分散至单个细胞,即无成团菌丝体存在。将研磨液吸入1.5ml的灭菌EP管中,加入100μl预热至35℃的裂解液,并且震荡摇匀5s,将EP管的盖子打开,放入功率为600W的微波炉中,微波时间100s(注意不要使菌液受热过度而喷出来。可以分20s一次,加热5次,每加热一次就拿出来震荡一次,使裂解液和细胞混匀)。微波后加入400μl的65℃预热的抽提液,倒置震荡5s。加入600μl的Tris饱和酚氯仿抽提,混匀5s,12000r/min离心5min。取离心后的上清液入另一只灭过菌的EP管中,加入等体积的异丙醇沉淀(或用两倍体积冰冻无水乙醇沉淀)。离心沉淀。用70%的乙醇再洗涤一次,离心后倒出乙醇,风干EP管,至无酒精气味后,加入30μl TE溶液(pH8.0)溶解,存于-20℃的冰箱中备用。
(3)基因组DNA检测 各菌种DNA样品取出2μl用于0.8%的琼脂糖凝胶电泳,用120V电压电泳40s后染色,在320nm紫外灯下观测。
(4)18S rRNA基因扩增 将提取的基因组DNA以一定的稀释度稀释后作为模板进行扩增,20μl体系包括1μl模板DNA,1μl Taq酶,2μl反应缓冲液,终浓度为2.5mmol/L的Mg2+,终浓度为100pmol的引物,2μl 250mmol/L dNTP。反应程序为:95℃ 4min,95℃ 1min,50℃ 1min,72℃ 2min,30个循环,循环结束后72℃延伸10min,反应在BioRad公司的Mycycler上进行。
2 结果与讨论
利用微波对6个属的13株丝状真菌进行DNA抽提研究,发现可以非常简便的抽提出基因组DNA,在电泳图上可以看见>20kb有清晰的条带(图1),并且以抽提出的DNA为模板,可以有效地扩增出18S rRNA基因(图2)。
真菌的破壁方法很多,常见的有液氮研磨和酶法溶胞,这两种方法都有各自的局限性,液氮不容易保存和使用,针对少量的样品而购买和储存液氮显得麻烦,一般的实验室也很少有液氮储存罐。酶法主要采用蜗牛酶和溶壁酶破壁[5],由于酶类较昂贵所以成本较高。我们的实验中对不同真菌的酶法处理效果不理想。有的实验室用溶壁酶处理,也是因为不易购买和价格过高而不能普遍运用。
Orsini等[6]较早运用微波法直接从土壤等环境样品提取细菌基因组DNA,可有效提取环境生物的基因组DNA,微波法提取基因组DNA在放线菌中已有运用[4],本研究证实微波法对真菌基因组DNA的提取也有较好的结果,微量的菌种就可以提出相当好的DNA,而且条带清晰。能很好的用于后续的基因扩增。
微波法提取真菌DNA有很多优点:①耗材少,费以微波法提取的基因组DNA为模板进行18S rRNA基因的扩增产物电泳图谱用少,所用的试剂都是一些常用的不贵的试剂,仪器也常见,研钵,微波炉,恒温水浴锅,12000r/min的离心机,避免了酶法溶胞和液氮破壁的高成本;②时间短,步骤简单,避免了液氮破壁的费时费力和酶法溶胞的费时,2h就能提出效果很好的基因组DNA;③效果好,质量高。综上所述微波法提取真菌基因组DNA是一种廉价,方便,迅速,简单,高质量的方法。
【参考文献】
[1] 闫培生,罗信昌,周启. 丝状真菌基因工程研究进展[J]. 生物工程进展,1999,19(1):36~41.
[2] 吴琦,王红宁,刘世贵. 三种黑曲霉细胞基因组DNA提取方法的比较[J]. 生物技术,2003,13(6):30~31.
[3] 何月秋. 真菌菌丝体培养和提取DNA方法的改进[J]. 菌物系统,2000,19(3):434.
[4] 徐平,李文均,徐丽华,等. 微波法快速提取放线菌基因组DNA[J]. 微生物学通报,2003,30(4):82~84.
[5] 李绍兰,周斌,杨丽源,等. 真菌DNA提取方法的改良[J]. 云南大学学报(自然科学版),2002,24(6):471~472.
[6] Orsini M, RomanoSpica V. A microwavebased method for nucleic acid isolation from environmental samples [J]. Lett Appl Microbiol,2001,33(1):17~20.

 
 
 
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