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当归六黄汤分煎与合煎样品中阿魏酸含量的比较

【西医学社会实践论文】作者:钟正灵 梁光义 张丽艳 靳凤云 曹佩雪 杨玉琴【摘要】 目的对当归六黄汤分煎与合煎样品中阿魏酸的含量进行比较,从而为其临床应用提供依据。方法采用反相液相色谱法,DIKMA ODS-C18柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),流动相为0.085%磷酸-乙腈,流速1.0 ml·min-1,柱温35℃,检测波长326 nm。结果当归六黄汤分煎样品中阿魏酸含量明显高于合煎样品。结论能为当归六黄汤分煎颗粒的临床应用提供一定的参考。
【关键词】 当归六黄汤 阿魏酸 高效液相色谱法
Abstract:ObjectiveTo compare the content of ferulic acid in single medicine decoction and mixed medicine decoction of TangKuei Six Yellow decoction, and provide a scientific basis for the use of TangKuei Six Yellow decoction in clinic. MethodsThe samples were determined by HPLC. DIKMA ODS-C18 column (5 μm,4.6 mm×250 mm)was used, the mobile phase consisted of 0.085% phosphoric-acetonitrile with flow rate 1.0 ml·min-1.The detection wavelength was set at 326 nm and the column temprature was 35℃.ResultsThe content of ferulic acid in single medicine decoction was higher than that in mixed medicine decoction.ConclusionIt can be used in clinic as a reference.
Key words:TangKuei Six Yellow decoction; Ferulic acid; HPLC
当归六黄汤出自李东垣《兰室秘藏》,由当归、生地黄、熟地黄、黄连、黄柏、黄芩、黄芪7味中药组成。用于发热盗汗,面赤心烦,口干唇燥,大便干结,小便黄,舌红苔黄,脉数。主治阴虚火旺证。临床上常用于治疗阴虚火旺所致的盗汗[1]。随着人们生活水平的提高、生活节奏的加快,近年出现了中药配方颗粒。中药配方颗粒是以批量的单味中药饮片为原料,分别加水煎煮、浓缩、干燥而得,经单剂量包装,使用时按处方混合后开水冲服[2],与中药汤剂的分煎相似。传统中药汤剂是按方配药,加水共煎而得,即合煎。中药配方颗粒汤剂与传统汤剂的化学成分、药效是否有明显的差异,中药配方颗粒是否应广泛应用于临床,还存在争论。本实验以当归中阿魏酸为指标性成分,采用HPLC法比较该方“分煎”和“合煎”制得的汤剂中阿魏酸的含量是否有差异,从中药复方汤剂中有效成分的含量方面为中药配方颗粒应用于临床提供一定理论依据。
1 仪器与试药
Aglient1100高效液相色谱仪(包括真空脱气机,自动进样器,四元泵,DAD检测器),HP1100/ WIND3D化学工作站。阿魏酸对照品(批号:110773-200611,供含量测定用)购自中国药品生物制品检定所;甲醇为色谱纯;水为纯净水;其它试剂均为分析纯。
药材经贵阳中医学院生药实验室董丽莎教授鉴定,当归为伞形科植物当归Angelica sinensia(Oliv.)Diels的干燥根,黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根,黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.的干燥根茎,黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮,黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.var. mongholicus (Bge.)Hsiao的干燥根,地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜或干燥块茎。
2 方法与结果
2.1 色谱条件色谱柱为DIKMA ODS-C18(5 μm, 4.6 mm×250 mm);以0.085%磷酸-乙腈为流动相梯度洗脱,0~31 min乙腈14.5%,31~40 min乙腈60%,40~48 min乙腈14.5%; 流速1.0 ml/min;检测波长326 nm,柱温35℃。
2.2 对照品溶液的制备精密称定阿魏酸对照品适量,加70%甲醇制成每毫升含12.48 μg溶液,备用。
2.3 供试品溶液制备分别精密称取干燥的当归六黄汤分煎与合煎浸膏粉约1.0 g,置250 ml圆底烧瓶中,加70%甲醇100 ml,称重,加热回流30 min,放冷,补重,过滤,取续滤液过0.45 μm微孔滤膜即得供试品溶液。
2.4 阴性样品的制备按照处方比例称取除当归外的各味药材干浸膏粉,混合均匀,称取适量,按照“2.3”项下的方法制备,在“2.1”项的色谱条件下进行测定,在阿魏酸出峰位置阴性对照液无干扰。
按照处方称取除当归外的各味药材,加20倍量的水,煎煮至10倍量,浓缩,减压干燥。得干浸膏粉,称取适量,按照“2.3”项的制备方法进行制备,在“2.1”项下的色谱条件下进行测定,在阿魏酸出峰位置阴性对照液无干扰。对照品、样品色谱见图1~3。
2.5 线性关系考察分别精密吸取对照品溶液1,2,4,6,8,10 ml于10 ml容量瓶中,加70%甲醇稀释至刻度,摇匀。在上述色谱条件下进样10 μl,按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值(A)为纵坐标,进样量(X)为横坐标,绘制标准曲线,计算得回归方程为A=5 613.1C-0.818 6,r=0.999 7,阿魏酸在0.012 48~0.124 8 μg范围内线性关系良好。
 
2.6 精密度实验精密吸取阿魏酸对照品溶液10 μl,连续进样6次,在上述色谱条件下测定峰面积,结果RSD=0.31%,表明精密度良好。
2.7 重复性实验精密称取同一批分煎浸膏粉、合煎浸膏粉各6份,按上述供试品溶液的制备方法和色谱条件测定,计算阿魏酸的含量,RSD分别为0.0104%(n=6)、0.8841%(n=6)。结果表明该方法具有良好的重复性。
2.8 稳定性实验精密称取分煎浸膏粉、合煎浸膏粉各1.0 g,按供试品溶液的制备方法处理,分别在0,1.5,3,4.5,6 h进样,按上述色谱条件下测定,RSD分别为2.40%,2.22%,表明当归六黄汤分煎、合煎样品溶液在6 h内稳定。
2.9 加样回收率实验分别精密称取已知含量分煎浸膏粉、合煎液浸膏粉各9份,加入适量阿魏酸对照品溶液,按供试品溶液制备方法处理,上述色谱条件下测定,RSD分别为2.05%,1.95%。结果见表1~2。表1 分煎之加样回收率实验结果(略)表2 合煎之加样回收率实验结果(略)
2.10 样品含量测定按照供试液制备方法分别处理6份样品,在“2.1”项色谱条件下进行测定,结果分煎样品与合煎样品平均含量(mg/处方)分别为:5.411,2.973。
2.11 当归六黄汤分煎样品与合煎液样品中平均含量的比较
2.11.1 两种供试品精密度的比较当归六黄汤分煎、合煎样品阿魏酸含量分别为 n1=6 1=5.411,n2=6, 2=2.973,计算得 S1=0.000 753,S2=0.000 632;f1=6-1=5,f2=6-1=5
查表得F0.05,5,5=5.05 根据公式F=S12S22=1.42 F
2.11.2 两种样品中阿魏酸平均含量的比较可求得合并标准偏差为:
S=∑(x1i-1)2+∑(x2i-2)2(n1-1)+(n2-1)=7.1×10-4
t=︳1-2Sn1n2n1+n2=59 47.69
查表,当置信度为95%,f= n1+ n2-2=10时, t0.05,10=2.23。
t> t0.05,10,故两种供试品阿魏酸的平均含量之间存在显著性差异。
即当归六黄汤分煎样品与合煎液样品中阿魏酸平均含量之间存在显著性差异。
3 讨论
对提取溶媒进行考察,根据文献资料[3,4]采用不同浓度的甲醇与乙醇回流提取,实验结果表明用70%甲醇为提取溶媒时,阿魏酸的含量较高,且峰形较好。
由于阿魏酸为弱酸,在酸性溶剂中能抑制分解,根据文献资料采用[5]甲酸∶甲醇(5∶95) 为流动相,样品峰与杂质峰分离度达不到要求。采用甲醇-水[6] (35∶65)为流动相样品峰拖尾且与杂质峰R<1.5,采用2005版《中国药典》Ⅰ部当归中阿魏酸测定项下所用流动相乙腈-0.085%磷酸(17∶83),样品峰与杂质峰R<1.5,峰形难看。调整流动相比例进行梯度洗脱,0~31 min乙腈14.5%,31~40 min乙腈60%,40~48 min乙腈14.5%,分离度、保留时间、峰形均好于《中国药典》方法,故最后采用此流动相。
当归六黄汤分煎样品中阿魏酸含量比合煎样品高。组方中黄连、黄柏均含有小檗碱,在合煎过程中酸碱可能发生中和反应,从而导致合煎样品中阿魏酸含量偏低。但中药复方成分复杂,其原因还需作进一步深入的考察。
【参考文献】
[1]李怀珠.当归六黄汤加味治疗阴虚火旺型盗汗130例[J].中国社会医师,2005,7(12):35.
[2]周嘉林,王永山.中药浓缩颗粒临床应用与研究[M].北京:人民卫生出版社,1998.
[3]颜春华. HPLC法测定柏子养心丸中阿魏酸的含量[J].辽宁中医学院学报,2005,7(1):67.
[4]张玉爱,吴泽榕,郑起平. HPLC测定养血当归软胶囊中阿魏酸的含量[J].中成药,2006,28(4):599.
[5]黄罗生,郭健新,刘咏梅,等. HPLC测定阿魏酸含量的探讨[J].中成药,2004,26(2):134
[6]兰 顺,叶冬梅. HPLC测定复方川芎胶囊中阿魏酸的含量[J].中成药,2004,26(10):附18.

 
 
 
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