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螺旋腺瘤临床病理分析螺旋腺瘤临床病理分析
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【防疫医学论文】【摘要】 目的:研究高密度壳聚糖（high density chitosan，HDC）对小鼠L929细胞的毒性，以期为其临床安全应用提供依据。方法：观察不同浓度HDC浸提液对体外培养L929细胞形态的影响，四甲基偶氮唑蓝（methlthiazolyl tetrazolium,MTT）实验评价HDC对L929细胞生长和增殖的影响，流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测HDC浸提液对L929细胞凋亡的影响，单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis,SCGE）检测不同浓度HDC浸提液对培养的L929细胞DNA分子损伤的影响。结果：HDC浸提液对体外培养的L929细胞形态无明显影响，对细胞生长和增殖无明显抑制作用,不同浓度材料浸提液的细胞毒性均为01级；FCM示凋亡率随浸提液浓度升高而升高，但不明显;SCGE结果显示HDC对L929细胞的DNA无明显损伤作用。结论：HDC具有良好的细胞相容性和分子相容性，可为临床的安全应用提供依据。
【关键词】 高密度壳聚糖 分子生物相容性 单细胞凝胶电泳
壳聚糖是一种可被降解吸收、具备良好生物相容性的高分子材料，具有多种作用[12]。其衍生物高密度壳聚糖（high density chitosan，HDC）由于还可被应用于填补骨缺损、治疗骨折及具比壳聚糖更明显的降血脂等作用而受到重视，并成为医学工作者研究热点之一，但其相容性评价鲜见报道。随着生物材料相容性研究逐渐向分子水平的迈进，生物材料评价逐渐进入整体、细胞和分子水平的全面评价阶段。为确保生物材料临床应用的安全性,本研究拟通过形态学观察、四甲基偶氮唑蓝（methlthiazolyl tetrazolium,MTT）实验、流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测和单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis,SCGE）来研究HDC浸提液对L929细胞的影响，进而评价HDC毒性、细胞相容性和分子相容性，期望能为其临床安全应用提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
HDC(上海优品生物有限公司提供，脱乙酰度90%),L929细胞株(购自中科院上海细胞研究所)，RPMI 1640培养基（GIBCO公司提供），MTT（美国 SIGMA公司提供），低熔点琼脂糖（南京生兴生物技术有限公司提供），荧光显微镜（日本Nikon公司提供）。
1.2 实验方法
1.2.1 HDC浸提液制备和实验分组
1.2.1.1 HDC浸提液制备 HDC经紫外照射灭菌后，按试样0.15 g·ml-1的质量浓度，在37℃、72 h条件下，浸提后过滤除菌保存备用，浸提介质为含10%小牛血清RPMI 1640培养基。
1.2.1.2 实验分组 (1)阴性对照组,RPMI 1640培养液组；(2)～(5)25%、50%、75%、100% HDC浸提液组；(6)阳性对照组，0.7%聚丙烯酰胺单体(PVC)（SCGE实验阳性组为0.01 mol·L-1 H2O2组）。
1.2.2 HDC的毒性研究
1.2.2.1 细胞形态观察 0.25%胰酶消化对数生长期的L929细胞，传代后用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液及不同浓度(25%、50%、75%、100%)HDC浸提液培养细胞，然后分别于12、24、72 h倒置显微镜下观察细胞形态、细胞贴壁情况并拍照。（1）无毒：细胞形态正常，贴壁生长好，细胞呈梭形或不规则三角形。（2）轻度毒性：细胞贴壁生长好，但可见少数细胞圆缩，偶见悬浮细胞。（3）中度毒性：细胞贴壁生长不佳，细胞圆缩较多，达1/3以上，见悬浮死细胞。（4）重度毒性：细胞基本不贴壁，90%以上为悬浮死细胞。
1.2.2.2 MTT实验 实验以RPMI 1640培养液稀释100%浸提液至所需浓度。将L929细胞复苏、传代后,于对数生长期经胰蛋白酶消化制成6×104 ml-1的细胞悬液，接种于96 孔培养板，24 h后换液，72 h 后加入MTT，4 h后加入二甲基亚砜(DMSO),震荡10 min后在免疫酶标仪上测定493 nm处光密度(optical density,OD)值。计算细胞增殖率(relative growth rate,RGR或proliferation rate，PR)。RGR(%)=实验组OD均值／阴性对照组OD均值×100%。根据RGR 进行细胞毒性分级:99≤RGR≤100时，细胞毒性为0 级；75≤RGR<99时，细胞毒性为1 级；50≤RGR<75时，细胞毒性为2级；25≤RGR<50时，细胞毒性为3 级；1≤RGR<25时，细胞毒性为4 级；0≤RGR<1时，细胞毒性为5 级。0 级和1 级被认为没有细胞毒性，2 级为轻度细胞毒性或结合细胞形态综合评价，3 级和4级为中度细胞毒性，5 级为明显的细胞毒性，35级为不合格材料。
1.2.2.3 FCM检测细胞凋亡 收集处理过的细胞，PBS洗涤2次，70%冰乙醇4℃固定24 h以上。检测前用PBS洗涤2次，碘化丙啶染色，FCM检测分析。
1.2.2.4 SCGE检测DNA损伤 在培养的L929细胞中加入不同浓度HDC浸提液后，继续在CO2培养箱中培养6 h和48 h，收集细胞。采用自制磨毛载玻片制三明治胶，每组平行做胶板2张。第1、3层为0.75%的正常熔点琼脂糖，第2层为含处理后细胞的浓度为0.6%的低熔点琼脂糖。经裂解、电泳、中和、染色后，在24 h内荧光显微镜下放大200倍观测记数。镜下每组观察100个细胞，根据细胞的损伤情况将细胞分成5级：0、1、2、3、4级(1～4级为损伤细胞)，计算彗星率（彗星率=彗星细胞数/100×100%）。
1.3 统计学处理
实验差异显著性采用t检验和χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 形态观察
倒置显微镜下观察发现，不同浓度HDC浸提液组及阴性对照组，12 h时细胞已贴壁，细胞突舒展，24 h时细胞充分展开；而阳性材料组细胞大多呈悬浮状，很少贴壁。72 h时HDC及阴性材料组细胞明显增多，排列规则密集，细胞呈梭形、三角形或不规则形，偶见圆形细胞；阳性组大部分细胞呈圆形、核固缩，仅仅少数细胞贴壁，死亡细胞数明显增多。
2.2 MTT检测
25%、50%、75%、100%HDC浸提液组增殖率依次为85.58%、88.50%、97.13%、94.47%，依不同浓度HDC浸提液细胞毒性级数01级，属无毒范畴，为合格生物材料（表1）。表1 MTT法检测的L929细胞增殖率、抑制率和毒性分级 1)与阴性对照组比较，P＞0.05；2)与阳性对照组比较，P＜0.05
2.3 FCM检测凋亡结果
L929细胞经处理48 h后，25%、50%、75%、100%HDC浸提液组凋亡率依次为0.02%、1.42%、1.47%、1.91%、2.39%和69.33%（图1）。
2.4 SCGE检测
阴性对照组,25%、50%、75%、100%HDC浸提液组及0.01 mol·L-1H2O2组处理L929细胞6 h和48 h后，彗星细胞数依次为3、2、3、3、5、80和3、3、3、5、6、100。χ2统计分析示同浓度组不同时间点比较、同时间点不同浓度组比较，均P＞0.05，无显著性差异；不同时间点不同浓度各组与阳性对照组比较，均P＜0.01，有显著性差异。
3 讨 论
生物材料是指其与生物系统相作用，对人体组织、血液不产生副作用的材料。生物相容性指生物材料与人体组织接触后，在材料与组织界面发生一系列作用后被人体组织所接受的性能。生物材料由于要应用于人体组织，所以一直备受关注和重视。
A.阴性对照组；B～E.依次为25%、50%、75%、100% HDC浸提液组；F. 阳性对照组
图1 FCM检测细胞凋亡结果
生物材料应用于临床必须具备良好的生物相容性，生物相容性研究也一直是生物材料应用的中心话题。目前认为其检测主要包括体内实验和体外实验。体外实验较体内实验具有许多优点[34]，如可快速有效地进行毒性筛选，在评价材料对细胞生长、代谢及增殖影响时具有实验条件易于控制、可标准化、可定量、重复性好和明显缩短研究周期等优点，而体内实验由于存在许多混杂因素的影响和干扰，加上个体差异，很难获得客观、准确的实验资料。生物材料中所含成分对材料本身的生物相容性也存在影响[56]。Ioletti等[7]认为，体外材料与细胞共培养时，一旦材料有毒物质释放，细胞的增殖和形态就会发生改变，同时可直接观察到细胞在材料表面的黏附情况及界面反应，从而为材料的细胞相容性提供最直观的证据。本研究中，我们采用体外实验方法，用材料浸提液培养细胞，观察细胞形态、数量改变同时结合能量化细胞毒性方法即MTT实验结果初步判断材料是否具有毒性。MTT实验于1983年由Mosroam提出，其原理是活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能催化MTT形成紫色结晶物，该结晶物形成数量的多寡与活细胞数量和功能状态呈正相关，该方法能灵敏可靠地反映材料对细胞造成的毒性损害程度。通过实验发现在显微镜下L929细胞形态舒展，呈梭形、三角形或不规则形，贴壁生长良好，与阴性对照组无显著差别，参照形态分析标准，HDC无细胞毒性。MTT结果显示不同浓度HDC浸提液对细胞增殖无明显影响，RGR>75%，参照细胞毒性评价标准，细胞毒性分级为01级， HDC无细胞毒性。从而在形态学上和细胞增殖上证实HDC对L929细胞生长、增殖和代谢具有良好的细胞相容性。
凋亡[8]作为生物相容性评价的一个重要领域，是由基因调控的细胞主动结束生命的过程。当毒性材料作用于细胞后可引起细胞凋亡率的改变，因此可通过材料作用细胞后的细胞凋亡率改变来反映该材料的毒性。不同浓度HDC浸提液处理L929细胞后其凋亡率与阴性对照组比较，虽随浸提液浓度升高而轻度升高，但无显著差异，而与阳性对照组比较有显著差异，提示HDC无明显的致凋亡作用。
DNA分子损伤检测是遗传毒性研究的重要领域，也是生物材料分子生物相容性检测的一个重要内容。迄今为止，检测DNA损伤最灵敏的终点是检测DNA的断裂。我们选用了SCGE来检测HDC浸提液对L929细胞DNA分子的损伤影响，该方法的原理是将经DNA损伤剂处理后细胞DNA损伤形成链缺口，经电泳后产生典型的“慧星”图像，其拖尾的长度和密度与损伤程度呈正相关。我们采用了计算有尾细胞百分率的方法，研究了HDC对L929细胞DNA的损伤作用，发现HDC对L929细胞DNA无明显损伤作用，从而显示了HDC无明显的遗传毒性作用。
综上所述，本次实验结果显示，HDC作用于L929细胞后，细胞生长良好，细胞增殖率高，对L929细胞凋亡率无明显影响，对L929细胞DNA分子无明显的损伤作用，从而表明HDC是一种无毒材料，具有良好的细胞相容性和分子相容性，可为临床安全应用提供理论依据。
生物材料应用于临床必须具备良好的生物相容性，其检测主要包括体内实验和体外实验。体外实验较体内实验具有许多优点[34]，生物材料中所含成分对材料本身的生物相容性也存在影响[56]。Ioletti等[7]认为，体外材料与细胞共培养时，一旦材料有毒物质释放，细胞的增殖和形态就会发生改变，同时可直接观察到细胞在材料表面的黏附情况及界面反应，从而为材料的细胞相容性提供最直观的证据。本研究中，我们采用体外实验方法，将材料浸提液培养细胞，观察细胞形态、数量改变同时结合能量化细胞毒性方法即MTT 实验结果初步判断材料是否具有毒性。通过实验发现在显微镜下细胞形态舒展，贴壁生长良好，与阴性对照无显著差别，参照形态分析标准，HDC无细胞毒性。MTT结果显示不同浓度HDC浸提液对细胞增殖无明显影响，RGR(%)>75，参照细胞毒性评价标准，细胞毒性分级为01级，HDC无细胞毒性。从而在形态学上和细胞增殖上证实HDC对L929细胞细胞生长、增殖和代谢具有良好的细胞相容性。
凋亡[8]作为生物相容性评价的一个重要领域，是由基因调控的细胞主动结束生命的过程。当毒性材料作用于细胞后可引起细胞凋亡率的改变。因此可通过材料作用细胞后的细胞凋亡率改变来反映该材料的毒性。不同浓度HDC浸提液处理L929细胞后其凋亡率与阴性组相比，虽随浸提液浓度升高而轻度升高，但无显著差异，而与阳性组比有显著差异，提示HDC无明显的致凋亡作用。
DNA分子损伤检测是遗传毒性研究的重要领域，也是生物材料分子生物相容性检测的一个重要内容。我们选用了SCGE 来检测HDC浸提液对L929细胞DNA分子的损伤影响，其方法原理是将经DNA损伤剂处理的细胞经电泳后产生典型的“慧星”图像，其拖尾的长度和密度与损伤程度呈正相关。我们采用了计算有尾细胞百分率的方法，研究后发现HDC对L929细胞DNA无明显的损伤作用，从而显示了HDC无明显的遗传毒性作用。
综上所述，本次实验结果示HDC作用L929细胞后，细胞生长良好，细胞增殖率高，对L929细胞凋亡率无明显影响，对细胞DNA分子无明显的损伤作用，从而表明HDC是一种无毒材料，具有良好的细胞相容性和分子相容性，可为临床安全应用提供理论依据。
【参考文献】
[1]MAESA Y,KIMNRA Y.Antitumor effects of various lowmolecularweight chitosans are due to increased natural killer activity of intestinal intraepithelial lymphocytes in sarcoma 180bearing mice [J].J Nutr,2004,134(4):945501.
[2]ZAHORSKAMARKIEWICZ B,KROTKIEWSKI M,OLSZANECKAGLINIANOWICZ M,et al.Effect of chitosan in complex management of obesity [J].Pol Merkur Lekarski,2002,13(74):129132.
[3]METZLER V,BIENERT H,LEHMANN T,et al.A novel method for quantifying shape deformation applied to biocompatibility testing [J].ASAIO J,1999,45(4):264271.
[4]NELSON S K,WATAHA J C,NEME A M,et al.Cytotoxicity of dental casting alloys pretreated with biologic solutions [J].J Prosthet Dent,1999,81(5):591596.
[5]GECKELER K,WACKER R,MARTINI F,et al.Enhanced biocompatibility for SAOS2 osteosarcoma cells by surface coating with hydrophobic epoxy resins[J].Cell Physiol Biochem,2003,13(3):155164.
[6]SJOGREN G,SLETTEN G,DAHL J E.Cytotoxicity of dental alloys,metals,and ceramics assessed by Millipore filter,agar overlay,and MTT tests[J].J Prosthet Dent,2000,84(2):229236.
[7]IOLETTI D P,TAKEI H,LIN H,et al.The effects of calcium phosphate cement particles on osteoblast function[J].Biomaterials,2000,21(10):11031114.
[8]翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学[M].北京：高等教育出版社，2000:454457.
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