| 摘要 | 第1-15页 |
| ABSTRACT | 第15-20页 |
| 缩略语表 Abbreviation | 第20-21页 |
| 第一章 文献综述 | 第21-49页 |
| 1 前言 | 第21页 |
| 2 卵黄抗体的研究概况 | 第21-26页 |
| ·卵黄抗体及其特点 | 第21-25页 |
| ·卵黄抗体的结构 | 第21-22页 |
| ·卵黄抗体的诱导产生和转运 | 第22-23页 |
| ·卵黄抗体的稳定性 | 第23-24页 |
| ·卵黄抗体的消化吸收特性 | 第24页 |
| ·卵黄抗体的安全性 | 第24-25页 |
| ·卵黄抗体抗感染的应用研究 | 第25-26页 |
| 3 仔猪产肠毒素大肠杆菌性腹泻及其防治 | 第26-40页 |
| ·肠毒素大肠杆菌病原学特征 | 第26-34页 |
| ·肠毒素大肠杆菌的细菌学特征 | 第26页 |
| ·肠毒素大肠杆菌的致病因子 | 第26-34页 |
| ·肠毒素大肠杆菌的致病机理 | 第34-36页 |
| ·ETEC的黏附 | 第34-35页 |
| ·肠毒素的分泌 | 第35-36页 |
| ·肠毒素大肠杆菌的检测 | 第36-38页 |
| ·ETEC黏附素的检测 | 第36-37页 |
| ·ETEC肠毒素的检测 | 第37-38页 |
| ·肠毒素大肠杆菌与断奶仔猪腹泻 | 第38-39页 |
| ·肠毒素大肠杆菌腹泻的防治 | 第39-40页 |
| 4 抗ETEC菌毛蛋白卵黄抗体的研究及应用 | 第40-44页 |
| ·抗ETEC卵黄抗体防治制剂的研究应用 | 第41页 |
| ·抗ETEC卵黄抗体抗菌促生长剂的研究应用 | 第41-42页 |
| ·不同形式免疫原制备的抗ETEC卵黄抗体 | 第42页 |
| ·不同形式免疫原制备的抗ETEC卵黄抗体 | 第42-44页 |
| 5 重组蛋白抗原在卵黄抗体中的应用 | 第44-45页 |
| ·重组蛋白刺激蛋鸡免疫应答反应 | 第44-45页 |
| ·重组蛋白诱导卵黄抗体产生 | 第45页 |
| 6 ETEC黏附素基因的克隆表达 | 第45-48页 |
| ·ETEC菌毛抗原的单基因表达 | 第46-47页 |
| ·ETEC菌毛抗原的双基因表达 | 第47-48页 |
| 研究目的与意义 | 第48-49页 |
| 第二章 ETEC菌毛基因型的分子鉴定及在湖北省规模化猪场中的分布特征 | 第49-61页 |
| 1 前言 | 第49页 |
| 2 材料与方法 | 第49-52页 |
| ·菌株 | 第49页 |
| ·待测菌株及腹泻粪样 | 第49-50页 |
| ·试剂 | 第50页 |
| ·培养基 | 第50页 |
| ·缓沖液 | 第50页 |
| ·ETEC菌毛基因分子鉴定方法的建立 | 第50-52页 |
| ·引物设计与合成 | 第50页 |
| ·DNA模板的制备 | 第50-51页 |
| ·PCR检测方法的建立 | 第51页 |
| ·PCR产物的鉴定 | 第51-52页 |
| ·待测样品的检测 | 第52页 |
| ·腹泻粪样的采集 | 第52页 |
| ·DNA模板的制备 | 第52页 |
| ·PCR检测 | 第52页 |
| ·数据分析 | 第52页 |
| 3 结果与分析 | 第52-61页 |
| ·ETEC标准菌株的分子鉴定 | 第52-56页 |
| ·大肠杆菌分离株的检测 | 第56页 |
| ·腹泻粪样的检测 | 第56-58页 |
| ·肠毒素大肠杆菌菌毛基因分子鉴定方法的建立 | 第58页 |
| ·湖北省地区猪源大肠杆菌菌毛基因型K88、K99、987P、F41和F18的分布特征 | 第58-61页 |
| 第三章 肠毒素大肠杆菌K88、F18和987P菌毛亚单位基因的克隆表达 | 第61-85页 |
| 1 前言 | 第61-62页 |
| 2 材料和方法 | 第62-73页 |
| ·菌株和质粒载体 | 第62-64页 |
| ·试剂 | 第64页 |
| ·抗体 | 第64页 |
| ·培养基 | 第64页 |
| ·溶液 | 第64-66页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳缓冲液 | 第64页 |
| ·抗生素贮存液 | 第64-65页 |
| ·质粒提取缓沖液 | 第65页 |
| ·十二烷基硫酸钠-丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)缓冲液 | 第65-66页 |
| ·Western blotting缓沖液 | 第66页 |
| ·其它缓冲液 | 第66页 |
| ·目的基因的扩增 | 第66-68页 |
| ·引物设计合成 | 第66页 |
| ·DNA模板的制备 | 第66-67页 |
| ·PCR扩增 | 第67-68页 |
| ·PCR产物的琼脂糖凝胶检测 | 第68页 |
| ·PCR产物的回收纯化 | 第68页 |
| ·目的基因的克隆 | 第68-69页 |
| ·目的片断与pMD18-T载体的连接 | 第68页 |
| ·感受态细胞的制备——氯化钙法 | 第68页 |
| ·连接产物的转化 | 第68-69页 |
| ·质粒的小量制备(碱裂解法) | 第69页 |
| ·阳性克隆子的筛选 | 第69页 |
| ·重组表达质粒的构建 | 第69-70页 |
| ·目的基因的测序 | 第70页 |
| ·目的基因的测序 | 第70页 |
| ·重组表达菌的构建 | 第70页 |
| ·目的蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测 | 第70-71页 |
| ·目的蛋白的诱导表达 | 第70-71页 |
| ·蛋白质的SDS-PAGE检测 | 第71页 |
| ·表达产物可溶性分析 | 第71页 |
| ·表达产物的Western blotting检测 | 第71-73页 |
| ·电转 | 第71-72页 |
| ·染色 | 第72页 |
| ·封闭 | 第72页 |
| ·第一抗体和靶蛋白结合 | 第72页 |
| ·酶标二抗与硝酸纤维素滤膜的温育 | 第72页 |
| ·加入底物显色 | 第72-73页 |
| 3 结果与分析 | 第73-81页 |
| ·faeG、fasG及faeG-linker-fedF融合基因的PCR扩增 | 第73-74页 |
| ·faeG、fasG及faeG-linker-fedF融合基因的克隆 | 第74-76页 |
| ·重组原核表达质粒的构建 | 第76-78页 |
| ·重组原核表达质粒pET88的构建 | 第76-77页 |
| ·重组原核表达质粒pET987的构建 | 第77页 |
| ·重组原核表达质粒pET8818的构建 | 第77-78页 |
| ·faeG、fasG基因以及faeG-linker-fedF融合基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达 | 第78-80页 |
| ·faeG基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达 | 第78页 |
| ·fasG基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达 | 第78-79页 |
| ·融合基因faeG-linker-fedF在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达 | 第79-80页 |
| ·表达产物的可溶性分析及Western blotting检测 | 第80-81页 |
| 4 讨论 | 第81-85页 |
| ·faeG单基因的克隆表达 | 第82页 |
| ·faeG和fedF双基因的融合表达 | 第82-83页 |
| ·fasG基因的克隆表达 | 第83-85页 |
| 第四章 响应面分析法优化重组K88ac菌毛亚单位蛋白在大肠杆菌中的诱 | 第85-94页 |
| 1 前言 | 第85页 |
| 2 材料和方法 | 第85-86页 |
| ·菌株和质粒 | 第85-86页 |
| ·试剂 | 第86页 |
| ·BL21(pET88)重组菌株的诱导表达的单次单因子试验 | 第86页 |
| ·BL21(pET88)表达产物的检测 | 第86页 |
| ·目的蛋白表达量的分析 | 第86页 |
| ·试验设计与数据统计分析方法 | 第86页 |
| 3 结果和分析 | 第86-91页 |
| ·BL21(pET88)重组菌株的诱导表达的单次单因子实验结果 | 第86-87页 |
| ·RSA优化试验的设计及结果 | 第87-88页 |
| ·RSA优化实验结果的计算与分析 | 第88-89页 |
| ·响应曲面的因素分析 | 第89-90页 |
| ·模拟优化寻找目的蛋白诱导表达条件的最佳点 | 第90-91页 |
| 4 讨论 | 第91-94页 |
| ·IPTG诱导时机、浓度和诱导时间对目的蛋白表达量的影响 | 第91-92页 |
| ·响应面分析法优化目的蛋白的诱导表达条件 | 第92-94页 |
| 第五章 重组菌毛蛋白rFaeG及融合蛋白FaeG-FedF免疫原性分析及诱导蛋鸡卵黄抗体的产生 | 第94-104页 |
| 1 前言 | 第94-95页 |
| 2 材料与方法 | 第95-99页 |
| ·实验动物 | 第95页 |
| ·试剂 | 第95页 |
| ·佐剂 | 第95页 |
| ·抗体 | 第95页 |
| ·缓沖液 | 第95-96页 |
| ·K88ac、F18ab和F18ac菌株的培养 | 第96页 |
| ·ETEC K88ac菌毛的提取纯化 | 第96页 |
| ·F18ac(2134P)菌毛蛋白的提取纯化 | 第96-97页 |
| ·重组菌毛蛋白rFaeG及融合蛋白FaeG-FedF的提取纯化 | 第97页 |
| ·包涵体的提取 | 第97页 |
| ·包涵体的提取 | 第97页 |
| ·包涵体的变性及复性 | 第97页 |
| ·K88ac菌毛多克隆抗体的制备 | 第97页 |
| ·间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价 | 第97-98页 |
| ·重组菌毛蛋白rFaeG及融合蛋白FaeG-FedF的Western blotting分析 | 第98页 |
| ·重组菌毛蛋白rFaeG和融合蛋白FaeG-FedF诱导卵黄抗体的产生 | 第98页 |
| ·蛋白油乳苗的制备 | 第98页 |
| ·蛋鸡的免疫 | 第98页 |
| ·喷雾干燥全蛋粉的制备 | 第98-99页 |
| ·数据分析 | 第99页 |
| 3 结果与分析 | 第99-102页 |
| ·Western blotting检测重组菌毛蛋白rFaeG以及融合蛋白FaeG-FedF的免疫原性 | 第99-100页 |
| ·重组菌毛蛋白rFaeG和融合蛋白FaeG-FedF诱导蛋鸡卵黄抗体的产生 | 第100-102页 |
| 4 讨论 | 第102-104页 |
| ·重组菌毛蛋白rFaeG及融合蛋白FaeG-FedF免疫原性分析 | 第102-103页 |
| ·重组菌毛蛋白rFaeG及融合蛋白FaeG-FedF诱导卵黄抗体产生 | 第103-104页 |
| 第六章 重组菌毛蛋白制备的卵黄抗体在断奶仔猪中应用及效果研究 | 第104-129页 |
| 1 前言 | 第104-105页 |
| 2 材料与方法 | 第105-112页 |
| ·菌株 | 第105页 |
| ·溶液 | 第105页 |
| ·喷雾干燥全蛋粉 | 第105页 |
| ·卵黄抗体体外抑制ETEC K88ac和F18ac黏附试验 | 第105-107页 |
| ·仔猪空肠上皮细胞的制备 | 第105-106页 |
| ·ETEC细菌培养物的制备 | 第106页 |
| ·ETEC体外黏附试验 | 第106页 |
| ·卵黄抗体体外抑制黏附试验 | 第106-107页 |
| ·试验一 重组蛋白rFaeG制备的卵黄抗体预防早期断奶仔猪腹泻的应用效果研究 | 第107页 |
| ·试验猪的选择与分组 | 第107页 |
| ·试验日粮 | 第107页 |
| ·试验二 在早期断奶仔猪日粮中添加rFaeG高免全蛋粉和血浆蛋白粉对仔猪腹泻与生长性能的影响 | 第107-108页 |
| ·试验猪的选择与分组 | 第107页 |
| ·试验日粮 | 第107-108页 |
| ·试验三 断奶仔猪日粮中添加喷雾干燥高免全蛋粉对仔猪腹泻与生长性能的影响 | 第108-112页 |
| ·猪场内ETEC菌毛基因型分布检测 | 第108页 |
| ·试验猪的选择与分组 | 第108页 |
| ·试验日粮 | 第108-112页 |
| ·试验猪的饲养管理 | 第112页 |
| ·腹泻情况记录和生长性能的测定 | 第112页 |
| ·数据分析 | 第112页 |
| 3 结果与分析 | 第112-124页 |
| ·卵黄抗体对ETEC体外黏附细胞的抑制作用 | 第112-115页 |
| ·重组蛋白rFaeG制备的卵黄抗体预防断奶仔猪腹泻的作用(试验一) | 第115页 |
| ·在早期断奶仔猪日粮中添加rFaeG高免全蛋粉和血浆蛋白粉对 仔猪腹泻与生长性能的影响(试验二) | 第115-116页 |
| ·断奶仔猪日粮中添加喷雾干燥高免全蛋粉对仔猪腹泻与生长性能的影响(试验三) | 第116-124页 |
| 4 讨论 | 第124-129页 |
| ·重组蛋白制备的特异性卵黄抗体对ETEC体外黏附细胞的抑制作用 | 第124-125页 |
| ·抗ETEC卵黄抗体预防断奶仔猪腹泻的应用效果 | 第125页 |
| ·重组蛋白为免疫原的抗ETEC卵黄抗体预防断奶仔猪腹泻的效果 | 第125-126页 |
| ·含特异性卵黄抗体的高免全蛋粉在断奶仔猪日粮中的应用 | 第126-129页 |
| 第七章 结语 | 第129-131页 |
| 1 结论 | 第129页 |
| 2 创新点 | 第129页 |
| 3 本研究不足之处 | 第129-131页 |
| 参考文献 | 第131-153页 |
| 附录 在读期间发表的主要研究论文 | 第153-154页 |
| 致谢 | 第154页 |
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