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补虚祛瘀法对创面修复瘢痕重塑期Smad3介导的信号转导通路的影响
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【药学实习报告范文】作者：秦海洸 何长杰 唐汉钧【摘要】 目的研究补虚祛瘀法促进慢性难愈性创面愈合的机理。方法采用改良付氏大鼠模型为研究对象，分为生理盐水组、复黄生肌愈创油膏组、补虚方组、祛瘀方组、康复新组，运用免疫组化法分别研究各组第18天创面瘢痕组织中转化生长因子β1（TGF-β1）、Smad3的变化。结果第18天时，复黄生肌愈创油膏组TGF-β1表达高于生理盐水组，而Smad3分子的表达低于生理盐水组。结论瘢痕形成重塑期，补虚祛瘀法对TGF-β1 → Smad3信号转导通路的调控起着重要作用。
【关键词】 补虚祛瘀法； 创面修复； 瘢痕； Smad3； 转化生长因子β1
Abstract：ObjectiveTo research the mechanism of chronicity raw surface coalesced by the method of reinforce dificiency and removing blood stasis.MethodsWe divided rats into five groups:A(group of hpysiologic saline),B(group of Fuhuangshengjiyuchuang factis),C(group of reinforce dificiency),D(group of removing blood stasis) and E(group of Kangfuxin),and then treated them by different therapeutic methods.The changes of TGF-β1,Smad3 by immunohistochemistry at 18th day were observed.ResultsThe express of TGF-β1 of group B was higher than that of group A,while the express of Smad3 of group B was lower than that of group A.ConclusionThe method of reinforce deficiency and remodeling blood stasis can modulate TGF-β1 →Smad3 signal transduction.
Key words：Chronicity raw surface coalesced; Cicatricle; Smad3; TGF-β1
慢性难愈性创面成因复杂，类型多样，不仅从肉体和精神上给患者带来很大痛苦，同时也加重了社会和家庭的经济负担。中医药治疗慢性难愈性创面具有自身的优势和特色，在中医外科临床中已得到证实。本研究通过观察补虚祛瘀法对创面修复瘢痕重塑期Smad3介导的信号转导通路的影响，以阐明其作用机理，并为中医药治疗慢性难愈性创面提供理论依据。
1 材料与仪器
1.1 动物雄性清洁级SD大鼠30只，体重（400±20）g。
1.2 受试药物组成与制备药物：0.9% NS ；复黄生肌愈创油膏：大黄、鸡蛋黄油、血竭、珍珠粉等；补虚方： 鸡蛋黄油、珍珠粉等；祛淤方： 大黄、血竭等。以上诸药均由上海中医药大学附属龙华医院制剂室提供，同期制备及低温储藏。康复新，由四川佳能达攀西药业有限公司生产，批准文号为ZZ-5643-川卫药准字（1998）第013528号（本品系纯中药制剂）。
1.3 模型制备用药与试剂新洁尔灭酊，0.9％模型，0.1％盐酸氯胺酮(上海中西药业股份公司生产)。Smad3多克隆抗体，上海博士德公司产品，工作浓度1∶50；TGF-β1 多克隆抗体， Santa Cruz 公司产品，工作浓度1∶300；Envisim 试剂盒，丹麦DAKO公司产品。
2 方法
2.1 动物创面造模采用改良付氏糖尿病慢性难愈合创面大鼠模型方法［1］，雄性清洁级SD大鼠90只，体重（400±20）g，腹腔注射氯胺酮（0.2 ml/只），在无菌条件下用眼科手术剪刀在糖尿病模型大鼠背中部打一圆孔，深至筋膜，直径1.8 cm，创面面积为2.54 cm2 ，创面止血后无菌纱布包扎。
2.2 动物分组及用药分5个组：生理盐水组、复黄生肌愈创油膏组、补虚方组、祛瘀方组、康复新组。每组6只，均外敷单层浸渍药物的纱布；造模后当天开始给药，每天清洁创面，更换药物1次。
2.3 标本采集造模后第10天，用眼科手术剪分离留取各创面新生肉芽组织（500±10）mg。
2.4 免疫组化实验步骤①共5组标本均用1％中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，同时进行免疫组化Envisim二步法测定Smad3、TGF-β1。②图像分析选择200倍视野，每张免疫组化片任选3个视野，拍照后用 Adobe Photoshop CS 8.0 作分析，数据导入Excel，建立数据库。评定指标：实验结果以细胞及基质显色面积为标准，小于5％为“－”， 5％～10％为“＋/－”，10％～30％为“＋”，30％～50％为“＋＋”，50％～80％为“＋＋＋”，大于80％为“＋＋＋＋”。
2.5 统计学处理采用SPSS 11.5统计软件包对相关数据进行秩和检验(Kruskal Wallis Test)，并用SAS 8.0统计软件包做多个样本的两两比较。 统计数据以Mean rank和Chi-Square值表示，P<0.05，具有统计学意义。
3 结果
见表1。表1表明复黄生肌愈创油膏组TGF-β1表达高于生理盐水组，Smad3表达低于生理盐水组。
表1 实验性创面18 d肉芽组织中TGF-β1、Smad3的表达（略）
与生理盐水组比较，*P<0.05
4 讨论
复黄生肌愈创油膏是在“补虚祛淤”指导思想下配伍组方，专为慢性难愈性创面治疗而设。在多年的临床应用中，证明此油膏不但促愈作用明显，而且愈后瘢痕面积小，质量佳，皮色接近正常，愈后不易复发［2］。
在伤口愈合过程中，TGF-β1信号传递，首先是TGF-β1与其特异性Ⅰ、Ⅱ型受体结合成三元复合物，然后是Ⅱ型受体使I型受体GS区中的丝氨酸/络氨酸激酶发生磷酸化，最后由Smad3蛋白完成细胞内的信号传递［3］。转化生长因子(TGF-β1)是伤口愈合中重要的调控因子，同时也被公认为最强的致纤维化因子，激活细胞内信号转导分子Smad3是其促进胶原合成的必由途径［4］。Smad3介导的信号途径在体内抑制创伤愈合，因为祛除Smad3可引起重上皮化加速和伤口面积的缩小［5］。专家认为调节Smad3在组织修复过程中的表达成为治疗慢性难愈合创面理想的靶点［6］。然而，创面修复是一个动态的病理生理过程，在修复过程中分为连续而又相互重迭的3个阶段，即炎症期、肉芽组织形成期和瘢痕形成重塑期。不同时期的生长因子的表达各异，我们在研究中以TGF-β1 、Smad3为主线，选择皮肤全缺损动物模型第18天时观察不同方剂对创面修复瘢痕形成重塑期信号转导的影响。
第18天时，复黄生肌愈创油膏组TGF-β1表达明显高于生理盐水组，而Smad3分子的表达明显低于生理盐水组。据文献报道Smad3基因缺失不影响成纤维细胞合成和分泌基质［7］。在创伤局部注射野生型单核细胞同样具有刺激基质合成的作用，说明在整个创伤愈合过程中单核细胞能持久地维持局部TGF-β1的水平，提示创床基质合成和沉积不依赖于Smad3［8］。综上分析，我们认为复黄生肌愈创油膏在瘢痕形成重塑期的作用是促进了TGF-β1的合成，促进了成纤维细胞的增殖以及创面基质沉积，从而促进了创面愈合。
综上所述，复黄生肌愈创油膏通过对TGF-β1 、Smad3分子表达的影响，直接调控创面的修复，当然创面修复过程相当复杂，有众多细胞因子的参与以及多种因素的影响，但复黄生肌愈创油膏在整个创面修复过程中对TGF-β1 → Smad3信号转导通路的调控起着重要作用。
【参考文献】
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