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孕期、哺乳期暴露十溴联苯醚对子代大鼠免疫功能的影响
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【中医学论文下载】孕期、哺乳期暴露十溴联苯醚对子代大鼠免疫功能的影响摘要：目的 针对环境污染中十溴联苯醚对母婴健康存在潜在危害日益受到重视，研究经口胃灌十溴联苯醚对子代大鼠免疫功能的影响。方法 对母代孕期前后及哺乳期持续高剂量胃灌十溴联苯醚后，观察其子代大鼠免疫器官发育情况、T淋巴细胞亚群及T淋巴细胞增殖转化功能、NK细胞表面分子CD161表达及免疫球蛋白(IgM、IgG)等变化。结果 实验组免疫器官质量与对照组相比有变化，其T淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD4+及NK细胞表面分子CD161+百分比、CD4+/CD8+比值下降，CD4-CD8-百分比升高。实验组T淋巴细胞增殖转化功能下降不明显，其IgM含量明显低于对照组，IgG含量变化不明显。结论 母代持续暴露高剂量十溴联苯醚后，对子代免疫功能存在一定的不利影响。
关键词：十溴联苯醚；免疫功能；大鼠
近年来随着工农业生产和电子技术的蓬勃发展，环境污染与日俱增，人们正生活在“环境激素的海洋”之中。一种叫做多溴联苯醚的阻燃剂在众多环境激素中日益受到关注。它是一系列含溴原子的芳香族化合物，根据苯环上溴原子的个数和位置的不同，它共有209中同分异构体，主要用于涂料、塑料制品、泡沫填充材料、纺织品、地毯等生活用品，以及电子电器商品、建筑材料、飞机、汽车等工业产品中，而且PBDE在这些产品中的比重占到5%～30%。它具有很强的脂溶性，可以沉积在生物体的脂肪组织并进行累积，并且还能通过母乳、胎盘、脐带血沉积到下一代的体内并损害下一代神经系统发育、引起甲状腺内分泌及免疫系统功能紊乱等，甚至有可能致癌[1][2][3]。因为它的化学结构和多氯联苯醚(PCB)相似，故两者毒性也存在相似之处，而PCB已被证明对孕妇及胎儿的免疫功能存在危害，并已被禁用[4][5]。目前国外医学界对低溴联苯醚相关毒性研究较多且肯定，但对于高溴联苯醚对机体是否存在危害具有仍存在争议，主要是由于高溴联苯醚能在光分解作用下脱溴，最后对对机体产生毒害的到底是高溴还是低溴联苯醚亦或两者均有之，国内外目前尚无定论[6][7][8]。此外对于多溴联苯醚类化合物对机体免疫功能影响的研究鲜见报道,而有关高溴联苯醚类化合物对机体免疫功能影响的报道更是少之甚少,国内尚无相关性研究报道。本研究模拟母代孕期前后及哺乳期持续高剂量十溴联苯醚(PBDE-209)经口胃灌的暴露方式，着重研究多溴联苯醚类化合物中含高溴即十溴联苯醚(PBDE-209)对其子代机体基本免疫功能的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1主要仪器和试剂 Model550酶联免疫检测仪(美国Bio Rad公司)，LD25-2低速平衡离心机(北京医用离心机厂)，CO2培养箱(美国WTCB公司)，IMDM液(美国GIBCO公司)，PHA(华美生物有限公司)，LPS(华美生物有限公司)，CCK-8(株式会社日本同仁化学研究所上海代理公司 )，新生牛血清(英韦创津生物有限公司)，Facscalibur流式细胞检测仪(美国Becton dickinson 公司)，单克隆免疫荧光小鼠抗大鼠CD3，CD4，CD8，CD161抗体(FITC-CD3，PE-CD4，PE-CD8，FITC-CD161)及小鼠IgG1-FITC、IgG1- PE、IgG1- PE cy5(荷兰Serotech公司)，PBS(PH7.4，自配)，红细胞裂解液(自配)，1%多聚甲醛固定液(自配)、大鼠血清IgM及IgG定量检测ELISA试剂盒(晶美生物技术有限公司)。
1.1.2 实验动物 刚断乳后(出生21 d左右)的SPF级Wistar大鼠30只(购于南方医科大学实验动物中心)，其中雌性20只、雄性10只。
1.1.3 实验药物 PBDE-209购自美国Sigma-Aldrich公司。
1.2 方法
1.2.1动物模型建立 分组：将20只雌性大鼠分为2组，A组自购买日始胃灌溶有PBDE-209(0.3 g/kg•d)的花生油直至生育第一代仔鼠断乳，B组单纯胃灌等量花生油至第一代仔鼠断乳。取第一代仔鼠各15只做为观察对象，分为C组[断奶后继续胃灌溶有PBDE-209(0.3 g/kg•d)的花生油至成年]、D组(断奶后继续单纯胃灌等量花生油至成年)。将C、D两组做为主要观察对象。喂养方法：按SPF级饲养，自由采食，饮水，采光，自然日夜周期，胃灌时间均在每日傍晚。性成熟期大鼠按雌雄2∶1比例合笼。自然妊娠，分娩子代大鼠。
1.2.2 大鼠脾及胸腺细胞悬液制备 3%戊巴比妥钠按45 mg/kg剂量，腹腔麻醉大鼠后，无菌取脾及胸腺，电子天平称重并计算其指数(脏器指数=脏器mg/体质量g)。用5 ml注射器针芯及100目不锈钢滤网分别碾磨胸腺及脾，分别调整胸腺细胞悬液浓度为1×107/ml，脾细胞悬液浓度为1×107/ml 和5×106/ml备用。
1.2.3 T淋巴细胞亚群测定 动态观察子代大鼠在出生2周、7周时胸腺中淋巴细胞亚群表达情况，随机取实验组及对照组子代大鼠各20只，各个时期分别取10只进行观察，按上(1.1.2)无菌取胸腺，制作细胞悬液。取胸腺细胞悬液(浓度为1×107/ml)1 ml用单克隆免疫荧光抗体FITC-CD3，PE-CD4，PE-CD8各10 μl标记[9]，混匀，避光室温放置20 min后，各取已标抗的胸腺细胞悬液100 μl，加入2 ml PBS液(pH：7.4)混匀，室温放置10 min后，1000 r/min离心5 min，去上悬液，加入0.5 ml1%多聚甲醛固定液固定，流式细胞仪检测,并计算其百分比及CD4/CD8比值。
1.2.4 NK细胞表面标志CD161测定 观察对象及时机同上，按上(1.1.2)无菌取脾，制作细胞悬液。参照[9]取脾细胞悬液(浓度为1×107/ml)1 ml，用单克隆免疫荧光抗体FITC-CD161标记[10],混匀，避光室温放置20 min后，取已标抗的脾细胞悬液100 μl，加入红细胞裂解液2 ml，室温放置10 min，1000 r/min离心5 min，去上悬液，加入0.5 ml 1%多聚甲醛固定液固定，流式细胞仪检测，并计算其百分比。
1.2.5 T 淋巴细胞增殖转化功能测定(CCK-8法) 子代大鼠出生7周左右，取实验组及对照组子代大鼠各10只进行实验观察，按上(1.1.2)无菌取脾，制作细胞悬液。参照[9][11]取脾细胞悬液4 ml，离心清洗3次(1500 r/min 12 min)，最后用含10%新生小牛血清的IMDM液调整浓度为5×106/ml，分别加入96孔细胞培养板中，每孔加100 μl细胞悬液，观察T淋巴细胞增殖转化组每孔加PHA(每孔终浓度为5 μg/ml)100 μl，空白对照组每孔加IMDM液100 μl。放置37 ℃5%的CO2培养箱中培养72 h，在终止培养前6 h掺入CCK-8(CCK-8法实验原理类似于XTT法及MTT法)，每孔10 μl CCK-8，继续培养6 h后取出，在酶标仪450 mm处测定D(λ)值。
1.2.6 B淋巴细胞分泌的免疫球蛋白(IgM、IgG)定量检测 子代大鼠出生7周左右，取实验组及对照组各子代大鼠10只进行实验观察，心脏取血后离心留取上清液。按照血清免疫球蛋白定量检测ELISA试剂盒的步骤进行检测并记录结果。
1.2.7 统计学处理 所有数据均经SPSS10.0进行统计学处理，计量资料均用均数±标准差表示，采用t检验方法。
2 结果
2.1 体质量及脏器重量
动态观察子代大鼠在各个时期(出生1～2周、5周、6周)的发育情况，随机取实验组及对照组子代大鼠各40只，各个时期分别取10只进行观察，结果显示：
(1)子代大鼠出生体质量及出生数目：实验组的子代大鼠出生数目及出生体质量与对照组的子代大鼠相比较，明显较对照组要低，存在统计学差异(t=5.00， P≤0.01；t=-2.18， P≤0.05)。
(2)实验组子代大鼠生长发育过程中(出生1～2周、3周、5周、6周)其体质量变化与对照组子代大鼠相比较，实验组明显低于对照组，存在统计学差异(P<0.01)。
(3)实验组子代大鼠生长发育过程中(出生1～2周、3周、5周、6周)时免疫器官(胸腺、脾脏)的重量及指数与对照组相比较，实验组子代大鼠在出生1～2周、5周、6周时，胸腺重量明显低于对照组，存在统计学差异，胸腺指数则在出生1～2周、5周、6周时明显低于对照组，存在统计学差异。实验组子代大鼠在出生1～2周、5周、6周时，脾脏重量明显低于对照，存在统计学差异，脾脏指数则在出生1～2周、3周、6周时明显低于对照组，存在统计学差异，结果见表1。
2.2 T淋巴细胞亚群表达情况
结果显示：子代大鼠在出生2周时实验组CD3+百分比明显低于对照组，有统计学意义(t=6.34，P<0.01)。实验组CD4+/CD8+比值在出生2周、7周时均明显低于对照组，有统计学意义(t=3.44，P=0.006 ；t=6.08，P<0.01)。实验组CD3+CD8+、CD3+CD4+的百分比在出生2周时均低于对照组，有统计学意义(t=4.07， P<0.01；t=4.18，P<0.01)。
2.3 NK细胞表面标志CD161变化
子代大鼠在出生2周、7周时，实验组CD161+百分比均明显低于对照组，有统计学意义(t=6.90， P<0.01；t=2.20，P<0.01)。
2.4 T淋巴细胞增殖转化功能
在子代大鼠出生7周左右，实验组PHA刺激孔D(λ)值明显低于对照组，有统计学意义(t=3.54，P= 0.020)。实验组空白孔D(λ)值及刺激指数稍低于对照组，但没有显著差异 (t=0.50，P=0.624；t=1.67，P= 0.114)。
2.5血清免疫球蛋白IgM、IgG定量检测
实验组子代血清免疫球蛋白IgM含量明显低于对照组子代大鼠(t=4.03，P<0.01)，并有统计学意义。实验组子代血清免疫球蛋白IgG含量稍低于对照组子代大鼠，但没有显著差异(t=0.47，P=0.65)。
3 讨论
目前对于PBDE-209这类高溴联苯醚类化合物的研究尚不是很深入，因此国际上对于它的应用也是相当慎重的。欧盟组织已于2005年颁布有关严禁使用十溴联苯醚做为电器产品的防燃添加剂禁止令，但在一些其他非欧盟国家仍在继续使用。可见对于其的危害作用尚无统一定论，这就需要深入研究此类化合物对环境污染和人类健康的影响。
本研究着重于PBDE-209对基本免疫功能的影响。免疫系统又包括免疫器官、免疫细胞、免疫分子。免疫器官包括中枢免疫器官和外周免疫器官。在本研究中首先通过观察体质量和免疫器官的重量等指标的变化来研究PBDE-209在机体发育过程中产生的一般性毒性影响。通过实验观察发现，母代大鼠长期受PBDE-209暴露后，分娩的子代大鼠体质量及出生数目均低于对照组，可见PBDE-209对于大鼠的繁殖力及宫内胎儿生长发育有着一定危害。此外，动态观察子代大鼠体质量、免疫器官的重量变化发现：实验组子代大鼠体质量随着接触PBDE-209时间增长，其体质量一直低于对照组，而免疫器官(胸腺、脾脏)重量在出生1～2周、5周、6周时，实验组明显低于对照组。子代大鼠在妊娠期、哺乳期及生长发育期持续大剂量接触PBDE-209后，对免疫器官的发育和免疫细胞的数目是存在客观影响的，使其胸腺、脾脏细胞数目减少，重量减轻。
免疫功能是机体防御外来因素侵害的重要保证，包括细胞调节、体液调节和非特异性调节等多种途径。T淋巴细胞主要是参与细胞免疫功能的调节，也是执行免疫监视功能最重要的免疫活性细胞，有多种细胞亚群，其中CD3+代表成熟的总T细胞，CD4+主要正调节T、B淋巴细胞等，此外NK细胞做为第三类淋巴细胞系，也参与细胞免疫的调节和免疫监视，作用机制与CTL相似。B淋巴细胞则主要是参与体液免疫功能的调节。本实验通过流式细胞分析仪检测T淋巴细胞表面亚群及NK细胞表面分子CD161的百分比发现：子代大鼠在出生2周时实验组CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD4+百分比明显低于对照组，在出生2周、7周时实验组CD4+/CD8+比值明显低于对照组。可见，由于PBDE-209持续大剂量暴露，对实验组大鼠早期T淋巴细胞发育、T淋巴细胞功能产生影响，使大鼠细胞免疫调节功能出现异常。NK自然杀伤细胞表面标记分子CD161的百分比在出生2周、7周时明显低于对照组，特别是在子代大鼠发育早期更为明显。由此可见，PBDE-209对NK细胞的杀伤活性及防御监视功能也有一定抑制作用。由于早期PBDE-209对NK自然杀伤细胞杀伤活性抑制性作用明显，其功能受到一定损伤。同时故随着暴露PBDE-209时间增长，进一步继续影响NK细胞免疫防御功能，也有可能增加机体对疾病及肿瘤的易感性。在T淋巴细胞增殖转化功能实验中发现，实验组刺激指数(SI)稍低于对照组，但差异不显著。可见，PBDE-209对大鼠T淋巴细胞的增殖转化的影响不是很显著。然而本研究过程中，发现经PHA刺激后的实验组T淋巴细胞增值转化又是明显低于对照组，考虑产生这种现象有可能是子代大鼠接触PBDE-209时间不是足够长，以致不足以使T淋巴细胞增值转化功能受到抑制影响。
免疫球蛋白IgM是在体液免疫应答早期阶段产生的主要免疫球蛋白，IgG则是再次免疫应答产生的，且产生晚于IgM。检测血清中免疫球蛋白IgM、IgG含量发现，实验组IgM含量明显低于对照组，并有统计学差异，IgG含量变化不是很明显。可见，由于PBDE-209的持续影响，对早期B细胞的发育成熟存在着抑制性影响，随着大鼠体液免疫网络不断完善，PBDE-209对其影响又不是很显著了。因此，PBDE-209对于机体体液免疫应答早期也有可能存在明显的抑制作用，但对再次应答的作用影响则不明显。
综上所述，一系列免疫功能的基本指标变化表明 PBDE-209对于机体免疫功能早期产生的一系列影响是较为明显，特别是对细胞免疫调节的影响及NK细胞功能的影响，但对机体免疫功能产生的长远影响及机制仍需进一步的长时间实验跟踪观察才能得出肯定的结论。此外，由于PBDE-209的光化降解特性，其进入体内后到底是通过自身累积作用影响机体还是通过光分解脱溴成为低溴联苯醚类化合物或是两者共同作用于机体？这仍是一个需要继续探究的疑点。
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