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槐米固态发酵提高槲皮素含量的研究
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【药学论文】作者：徐萌萌，沈竞，徐春，王东溯，汪红，孙启玲【摘要】 目的 用该实验室筛选得到的一株黑曲霉固态发酵槐米并进行了培养条件优化，使其将槐米中的芦丁转化为槲皮素，提高槐米中槲皮素的含量。方法使用正交实验对种子培养条件及发酵条件进行优化。结果经优化后的菌体量可达8.32 g/L,优化的固态发酵条件芦丁转化率可达到98％以上。利用高效液相色谱法对发酵产物进行了鉴定，证明转化产物为槲皮素。结论通过微生物固态发酵槐米的方法，能够提高槐米中槲皮素的含量。
【关键词】 槐米；芦丁；槲皮素；黑曲霉；微生物转
Abstract：Objective Flos Sophorae Immaturus was subjected to solid state fermentation process by an Aspergillus niger strain to transform rutin into quercetin. MethodsThe conditions of culture and fermentation process were optimized by the orthogonal layout. Results By modulating the conditions, the biomass could reach 8.32 g/L and the transformation rate of rutin could reach 98%. It was proved that the product was quercetin by HPLC. ConclusionThe content of quercetin in Flos Sophorae Immaturus can be increased by the method of microbial transformation.
Key words：Flos Sophorae Immaturus; Rutin; Quercetin; Aspergillus niger; Microbial transformation
槐米（Flos Sophorae Immaturus）别名：白槐、柚花，为豆科植物槐Sophora japonica L.的花蕾。具有凉血止血, 清肝泻火的功能。多用于便血、痔血、血痢、崩漏、吐血等证的治疗［1］。其主要成分为黄酮醇类芸香苷—芦丁，此外还含有鞣质、植物甾类、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等成分［2，3］。
Wilfried Andlauer等［4］研究表明，槐米有效成分芦丁在进入肠道后，通过肠道微生物产生的β-葡萄糖苷酶和α－鼠李糖苷酶水解生成槲皮素发挥药效。槲皮素具有较好的祛痰、止咳、平喘作用，可降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管的脆性、降血脂、扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、抑制平滑肌收缩和淋巴细胞的增殖，有抑制血小板聚集和5－羟色胺的释放的作用，可明显降低血小板膜脂质的流动性等［5，6］。近几年研究表明，槲皮素是已知最强的抗癌剂之一［7］，在肿瘤化学治疗上的需求量很大，因此大力开发槲皮素具有十分良好的应用前景。
槐米中芦丁含量高达20% ～ 28%，现行槲皮素生产一般采用化学二步法工艺，即先从槐米中提取芦丁（方法包括碱溶酸沉或热煮提），再采用热酸水解的方法从芦丁制备槲皮素，其生产工艺对环境造成了酸、碱污染以及有机溶剂污染，操作繁琐复杂。而微生物与槐米共发酵是利用微生物生长过程中产生的酶，水解芦丁的糖苷键生成槲皮素。通过一步发酵直接提高槐米中槲皮素的含量，简化了操作过程。同时固态发酵所需设备简单，生产效率高，成本低，为中药中间体的加工提供了一条新工艺。
本文利用一株黑曲霉发酵槐米，通过对菌体生长、芦丁转化、槲皮素生成条件的研究，确定了最佳的发酵条件，并对产物进行了性质鉴定。
1 器材方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
菌种为本实验室从自然界分离筛选得到，经鉴定为一株黑曲霉Aspergillus niger，编号为HM-3。
1.1.2 材料与试剂
槐米，购于四川广松制药有限公司，自行打粉，粒度为20目。芦丁标准品，槲皮素标准品购于成都思科华有限责任公司；其它常用化学试剂均为市售分析纯。无机盐浓缩液：KH2PO4 20 g，MgSO4 10 g，（NH4）2SO4 10 g，加热溶解，定容至100 ml备用。
1.1.3 仪器HZQ-X100恒温恒湿培养箱（哈尔滨）；HZQ-C空气浴震荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；Shimadzu LC-10AT高效液相色谱仪(包括LC-10AD泵，7125RheODyne进样阀,SPD-10A紫外检测器,CBM-10A色谱工作站,日本岛津公司)。
1.2 方法
1.2.1 菌种培养条件的确定通过单因素实验初步考察玉米糖化液浓度、酵母膏的加入量范围。再按照正交实验表L9(34)分别对酵母膏，10%的麸皮汁，芦丁，玉米糖化液的添加量进行优化。接种量0.5%，30℃，180 r/min培养24 h。
1.2.2 芦丁及槲皮素的薄层色谱（TLC）检测方法取发酵样1 g，加入10 ml 80%乙醇50℃水浴5 min；聚酰胺薄膜（10 cm×10 cm），展开剂为无水乙醇∶水（9∶1），3%三氯化铁酒精溶液显色，观察。发酵样品点样量为10 μl，芦丁及槲皮素溶液点样量为5μl。
1.2.3 芦丁与槲皮素的高效液相色谱法（HPLC）检测方法色谱柱：Columns C18（250 mm×4.6 mm×5 μm）；柱温：25℃；流动相：甲醇－水（60﹕40）；磷酸调pH 3.5；流速0.9 ml/min；检测波长365 nm；进样量：10 μl。
芦丁标准曲线的制作：精密称取芦丁1.00 mg，置于1.5 ml的EP管中，加乙醇/水（1/1）溶解，精确吸取20，40，60，80，100 μl的对照品溶液到1.5 ml的EP管中并用乙醇/水（1/1）溶液稀释至100 μl，然后吸取20 μl进行测定。以峰高(Y)对含量（X）作回归计算，结果表明，在0.2～1 mg/ml范围内，芦丁有良好的线性关系，回归方程为Y＝2 197.3X－38.452，R=0.999 8。
槲皮素标准曲线的制作方法同上，以峰高(Y)对含量（X）作回归计算，结果表明，在0.2～1 mg/ml范围内，槲皮素有良好的线性关系，回归方程为Y＝2 378.5X+13.512，R=0.999 6。
1.2.4 发酵条件的确立
以槐米粉为培养基成分，配以适当的料水比，pH自然，121℃灭菌25 min。将菌种HM－3以菌丝体形式接入发酵培养基中，混合均匀后于恒温恒湿培养箱中培养。采用正交实验方法，确定无机盐浓缩液加入量、料水比、培养温度、环境湿度等发酵条件。
1.2.5 发酵产物的鉴定
采用HPLC法检测发酵前后的槐米成分与芦丁、槲皮素标准品相比较，确定微生物转化的物质。
2 结果与讨论
2.1 菌种培养条件的优化通过添加不同浓度的玉米糖化液作为菌体生长的碳源，确定玉米糖化液最佳加入量，实验结果如图1。
由图可知，玉米糖化液在浓度10%～20%时，菌体量呈递增趋势，说明糖化液在该浓度下适合微生物生长的需要；糖化液浓度在20%～100%时，菌体量呈递减趋势，这是由于培养基的糖浓度过高时产生了糖抑制作用，抑制了菌体的生长。因此将玉米糖化液的加入范围控制在20%左右。
酵母膏即是一种氮源，又是优良生长因子，在培养基中添加一定量的酵母膏可以促进菌体生长，结果见表1。表1 酵母膏添加量对菌体重量的影响（略）
添加不同浓度酵母膏对菌体生长量影响不大，因此从节省成本的角度考虑将正交实验酵母膏的加入量定在0.5%左右。
正交实验对菌种培养基的优化。结果见表2。表2 菌种培养基条件优化实验设计及结果分析（略）
经正交实验得到优化后的种子培养基为：0.75%酵母膏，10 ml 10%的麸皮汁，0.7%芦丁，18%糖化液。以最佳种子培养条件，得到的菌体量为8.32 g/L。
2.2 发酵条件的确立正交实验对槐米固态发酵的优化，结果见表3。表3 槐米固态条件优化实验设计及结果分析（略）
通过正交实验得到的槐米固态发酵最佳条件为：无机盐0.01%，料水比1∶2.5；培养温度37℃；环境湿度60%。对实验结果分析发现，培养基中只需添加少量的无机盐，因为槐米中丰富的营养成分已经能够满足菌体的生长。霉菌在生长时其呼吸极为旺盛，需要有一定的湿度，因此湿度较高，有利于菌体的生长。
按菌丝体接种量20%，最优发酵条件进行槐米固态发酵，经HPLC检测槐米中的芦丁在发酵38.5 h能转化98.3%，大幅度提高了槐米中槲皮素的含量。槐米固态发酵避免了液体发酵体积过于庞大、产生较多发酵废液的缺点，工业生产设备投资成本比液体发酵投资成本低，因此固态发酵更易进入工业化生产。
2.3 产物的鉴定将发酵前后的槐米进行HPLC分析，结果见图2。
芦丁标准品保留时间约在4.5 min，槲皮素标准品保留时间约在21.1 min，发酵前样品在保留时间4.5 min处有较大峰值，在保留时间21.1 min处有一小峰出现；对应发酵后样品在21.111 min出现较大峰值，而相对发酵前4.512 min保留峰值几乎消失。发酵后的产物与槲皮素标准品的出峰时间一致，因此证明微生物将槐米中的芦丁转化为槲皮素。
3 结论
通过微生物发酵可以显著增加槲皮素在槐米中的含量。由于槐米中鞣质等黏性成分的影响，液态发酵的浓度提升到一定量后粘稠度太大，搅拌不均匀，影响了氧传递等作用，致使芦丁转化率降低。较低的样品浓度又使发酵体积过于庞大，成本加大。采用微生物与槐米的固态发酵可以避免液态发酵的缺陷，固态发酵所用设备简单、原料投放量大、操作简便、成本低 ，通过分离纯化可以获得纯度很高的槲皮素。
微生物利用中药中的氨基酸、蛋白质、微量元素、维生素等多种营养成分生长繁殖，并产生糖苷酶将苷降解生成苷元，提高了活性物质在中药中的含量。利用微生物发酵工程技术发酵中药自动化程度高，生产工艺可控, 产品质量稳定, 符合中药现代化的要求。微生物固态发酵槐米的技术还可推广到其它中药，该技术为中药中间体的现代化加工提供了一条新途径。
【参考文献】
［1］郑虎占，董泽宏，佘靖，等.中药现代化研究与应用［M］.北京：学苑出版社，2000，4：3166..
［2］赵新芝，郭长强，韩莉，等. 槐米炮制研究进展［J］.时珍国医国药，2000，11（2）：183.
［3］吴虹霁,兰昌云,陈媛.槐花的研究进展［J］.广东微量元素科学，2006,13(6):1.
［4］Wilfried Andlauer, Claudia Stumpf, Peter Fu¨rst. Intestinal absorption of rutin in free and conjugated forms［J］. Biochemical Pharmacology, 2001, 62：369.
［5］Claudine Manach, Christine Morand, Christian Demigne, et al. Bioavailability of rutin and quercetin in rats［J］.FEBS Letters, 1997,409：12.
［6］杨秀伟，郝美荣，服部征雄（日）.中药成分代谢分析，第1版［M］.北京：中国医药科技出版社，2003：553.
［7］Jakubowicz Gil J, Paduch R , Gawron A , et al. The Effect of Heat Shock, Cisplatin, Etoposide and Quercetin on Hsp27 Expression in Human Normal and Tumour Cells［J］.Folia Histochem Cytobiol ,2002 ,40(1)：31.
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