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当前位置:教育论文中心首页--硕士论文--抗病RNAi与抗虫除草剂四价植物表达载体构建与转化甘蔗研究
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抗病RNAi与抗虫除草剂四价植物表达载体构建与转化甘蔗研究
 
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摘要第11-13页
Abstract第13-14页
1 引言第15-27页
    1.1 甘蔗产业概述第15-16页
        1.1.1 甘蔗的生物学性状及重要性第15-16页
        1.1.2 甘蔗的用途第16页
        1.1.3 甘蔗作物的分布第16页
    1.2 甘蔗花叶病概况第16-18页
        1.2.1 甘蔗花叶病发生与分布第16-17页
        1.2.2 甘蔗花叶病病症及危害第17页
        1.2.3 甘蔗花叶病毒结构、功能与分类第17-18页
    1.3 甘蔗黄叶病概况第18-20页
        1.3.1 甘蔗花叶病发生与分布第18-19页
        1.3.2 甘蔗花叶病病症及危害第19页
        1.3.3 甘蔗黄叶病传播途径第19页
        1.3.4 甘蔗黄叶病毒结构与分类第19-20页
    1.4 甘蔗螟虫概况第20-21页
        1.4.1 甘蔗螟虫发生第20页
        1.4.2 甘蔗螟虫病症及危害第20-21页
        1.4.3 甘蔗螟虫的防治第21页
    1.5 甘蔗生长期田间管理及人工投入第21页
    1.6 我国蔗价现状第21-22页
    1.7 提高甘蔗品种抗病虫的方法第22-24页
        1.7.1 杂交育种第22页
        1.7.2 组织培养第22-23页
        1.7.3 分子育种第23-24页
            1.7.3.1 功能基因表达蛋白产生的抗性第23页
            1.7.3.2 RNA介导的抗性第23-24页
    1.8 甘蔗遗传转化方法第24-25页
        1.8.1 农杆菌介导法第24页
        1.8.2 基因枪转化法第24页
        1.8.3 电击法第24-25页
        1.8.4 聚乙二醇(PEG)介导法第25页
    1.9 目的和意义第25-26页
        1.9.1 研究目的第25页
        1.9.2 研究意义第25-26页
    1.10 本研究研究的技术路线第26-27页
2 实验材料与方法第27-59页
    2.1 实验材料第27-30页
        2.1.1 植物受体材料第27页
        2.1.2 质粒与菌株第27-29页
        2.1.3 主要试剂及耗材第29页
        2.1.4 主要仪器设备第29-30页
    2.2 实验方法第30-59页
        2.2.1 PCR检测引物及程序第30-33页
        2.2.2 抗病虫害及除草剂四价表达载体的构建路线第33-34页
        2.2.3 三价中间载体的构建第34-45页
            2.2.3.1 中间载体pHANNIBAL的改造第34-38页
                2.2.3.1.1 目的片段的酶切第34页
                2.2.3.1.2 目的片段回收第34-35页
                2.2.3.1.3 目的片段的连接第35-36页
                2.2.3.1.4 重组质粒的转化第36页
                2.2.3.1.5 重组质粒的提取第36-37页
                2.2.3.1.6 重组质粒酶切验证第37-38页
            2.2.3.2 本实验保存的RNAi中间载体验证第38-39页
                2.2.3.2.1 质粒大小验证第38页
                2.2.3.2.2 PCR验证第38-39页
                2.2.3.2.3 酶切验证第39页
            2.2.3.3 本实验保存的质粒pUBCG0229-Cry1AC验证第39-41页
                2.2.3.3.1 质粒大小验证第40页
                2.2.3.3.2 PCR验证第40页
                2.2.3.3.3 酶切验证第40-41页
            2.2.3.4 抗虫中间载体pHANNIBAL-Cry1AC的构建第41-43页
                2.2.3.4.1 Cry1AC表达框引入中间载体pHANNIBAL-Z第41-42页
                2.2.3.4.2 重组质粒pHANNIBAL-Cry1AC的验证第42-43页
            2.2.3.5 抗病虫三价中间载体的构建第43-45页
                2.2.3.5.1 RNAi表达框引入重组质粒pHANNIBAL-Cry1AC第43-44页
                2.2.3.5.2 重组质粒的验证第44-45页
        2.2.4 四价表达载体的构建第45-49页
            2.2.4.1 表达载体pART27的改造第45-47页
                2.2.4.1.1 目的基因的克隆第45页
                2.2.4.1.2 目的基因的酶切与回收第45-46页
                2.2.4.1.3 目的片段的连接与重组质粒的转化第46页
                2.2.4.1.4 重组质粒pART27-Z的酶切验证第46-47页
            2.2.4.2 四价抗病虫害的表达载体的构建第47-49页
                2.2.4.2.1 三价抗病虫表达框插入表达载体pART27-Z第47-48页
                2.2.4.2.2 四价重组质粒的酶切验证第48-49页
        2.2.5 农杆菌工程菌获得与鉴定第49-50页
            2.2.5.1 农杆菌感受态细胞的制备第49页
            2.2.5.2 四价抗病虫害的表达载体转化农杆菌第49-50页
            2.2.5.3 农杆菌转化子鉴定第50页
            2.2.5.4 农杆菌工程菌株的培养与保存第50页
        2.2.6 四价表达载体的遗传转化第50-55页
            2.2.6.1 甘蔗愈伤诱导第50-51页
            2.2.6.2 受体材料抗生素PPT筛选浓度测定第51页
                2.2.6.2.1 愈伤组织阶段的PPT抗性试验第51页
                2.2.6.2.2 分化苗阶段的PPT抗性试验第51页
            2.2.6.3 农杆菌介导转化第51-52页
                2.2.6.3.1 农杆菌工程菌活化第51-52页
                2.2.6.3.2 共培养第52页
                2.2.6.3.3 抗性愈伤组织筛选与分化第52页
            2.2.6.4 基因枪转化第52-55页
                2.2.6.4.1 质粒DNA制备第52-53页
                2.2.6.4.2 仪器部件的灭菌第53页
                2.2.6.4.3 微弹制备第53页
                2.2.6.4.4 微弹涂膜第53-54页
                2.2.6.4.5 微弹包被验证第54页
                2.2.6.4.6 基因枪轰击第54-55页
                2.2.6.4.7 抗性愈伤组织筛选与分化第55页
        2.2.7 甘蔗抗性幼苗的生根培养与炼苗第55-56页
            2.2.7.1 抗性幼苗生根培养第55页
            2.2.7.2 幼苗炼苗第55页
            2.2.7.3 幼苗移栽第55-56页
            2.2.7.4 转基因植株统计第56页
        2.2.8 转基因植株分子鉴定第56-59页
            2.2.8.1 DNA水平检测第56-58页
                2.2.8.1.1 基因组DNA的制备与质量鉴定第56-57页
                2.2.8.1.2 抗性再生植株Bar基因PCR检测第57页
                2.2.8.1.3 双价抗病干扰序列和Cry1AC基因PCR检测第57-58页
            2.2.8.2 RNA水平检测第58-59页
                2.2.8.2.1 总RNA的提取与纯化第58-59页
                2.2.8.2.2 实时定量RT-PCR检测第59页
            2.2.8.3 蛋白质水平检测第59页
3 结果与分析第59-100页
    3.1 三价中间载体的构建第59-77页
        3.1.1 中间载体pHANNIBAL的改造第59-62页
            3.1.1.1 目的片段的酶切、回收第59-61页
            3.1.1.2 重组质粒pHANNIBAL-Z验证第61-62页
        3.1.2 RNAi中间载体验证第62-67页
            3.1.2.1 RNAi中间载体质粒电泳分析第62-63页
            3.1.2.2 RNAi中间载体PCR验证第63-66页
            3.1.2.3 RNAi中间载体酶切验证第66-67页
        3.1.3 质粒pUBCG0229-Cry1AC验证第67-69页
            3.1.3.1 质粒pUBCG0229-Cry1AC电泳分析第67-68页
            3.1.3.2 质粒pUBCG0229-Cry1AC的PCR验证第68-69页
            3.1.3.3 质粒pUBCG0229-Cry1AC的酶切验证第69页
        3.1.4 抗虫中间载体pHANNIBAL-Cry1AC的构建第69-72页
            3.1.4.1 Cry1AC表达框引入中间载体pHANNIBAL-Z第69-70页
            3.1.4.2 重组质粒pHANNIBAL-Cry1AC的验证第70-72页
                3.1.4.2.1 重组质粒大小及菌液PCR验证第70-71页
                3.1.4.2.2 重组质粒酶切验证第71-72页
        3.1.5 抗虫中间载体的构建第72-77页
            3.1.5.1 双价RNAi表达结构引入重组载体pHANNIBAL-Cry1AC第72-73页
            3.1.5.2 重组质粒验证第73-77页
                3.1.5.2.1 重组质粒大小验证第73-74页
                3.1.5.2.2 重组质粒菌液PCR验证第74-75页
                3.1.5.2.3 重组质粒酶切验证第75-77页
    3.2 抗病虫及除草剂四价表达载体的构建第77-84页
        3.2.1 表达载体pART27的改造第77-81页
            3.2.1.1 目的基因的克隆第77-78页
            3.2.1.2 目的基因酶切、回收第78-79页
            3.2.1.3 重组质粒pART27-Z的验证第79-81页
                3.2.1.3.1 重组质粒大小及PCR验证第79-80页
                3.2.1.3.2 重组质粒酶切验证第80-81页
        3.2.2 四价抗病虫害的表达载体的构建第81-84页
            3.2.2.1 三价抗病虫基因盒引入表达载体pART27-Z第81-82页
            3.2.2.2 重组质粒pART27-MC1YCP-Cry1AC、pART27-MC2YCP-Cry1AC和pART27-MYCP-Cry1AC的验证第82-84页
                3.2.2.2.1 四价重组质粒大小及PCR验证第82-83页
                3.2.2.2.2 四价重组质粒酶切验证第83-84页
    3.4 农杆菌工程菌获得与鉴定第84-85页
    3.5 四价表达载体的遗传转化第85-92页
        3.5.1 甘蔗愈伤诱导第85-86页
        3.5.2 受体材料抗生素PPT筛选浓度测定第86-87页
        3.5.3 农杆菌介导抗性愈伤组织筛选与分化第87-88页
        3.5.4 基因枪轰击第88-90页
            3.5.4.1 基因盒的制备第88-89页
            3.5.4.2 微弹包被验证第89页
            3.5.4.3 抗性甘蔗愈伤组织筛选与分化第89-90页
        3.5.5 甘蔗抗性幼苗生根及炼苗第90-91页
            3.5.5.1 抗性苗诱导生根第90页
            3.5.5.2 炼苗第90-91页
            3.5.5.3 幼苗移栽第91页
        3.5.6 抗性苗统计第91-92页
    3.6 抗性植株的分子鉴定第92-100页
        3.6.1 DNA水平检测第92-97页
            3.6.1.1 抗性筛选基因的检测第92-93页
            3.6.1.2 CryIAC基因和RNAi正反向序列检测第93-95页
            3.6.1.3 转基因植株统计第95-97页
        3.6.2 RNA水平检测第97-100页
            3.6.2.1 总RNA的提取与纯化第97页
            3.6.2.2 实时定量RT-PCR检测第97-100页
        3.6.3 蛋白质水平检测第100页
4 讨论第100-102页
    4.1 抗病虫害及除草剂四价表达载体的构建第100-101页
        4.1.1 RNAi技术第100-101页
        4.1.2 RNAi表达框与Cry1AC基因的结合第101页
    4.2 多个组成型启动子对转基因甘蔗抗病虫效果的影响第101-102页
    4.3 PPT的筛选浓度第102页
    4.4 RNA水平检测和感病分析第102页
5 结论第102-103页
6 展望第103-104页
参考文献第104-110页
附录第110-114页
致谢第114页

 
 
论文编号BS4505564,这篇论文共114
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