| 致谢 | 第1-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-10页 |
| 专业词汇中英文对照表 | 第10-20页 |
| 第一章 绪论 | 第20-42页 |
| ·导言 | 第20-21页 |
| ·mTORC1和mTORC2 | 第21-23页 |
| ·mTOR的保守结构域 | 第21页 |
| ·mTORC1和mTORC2的组成蛋白 | 第21-22页 |
| ·Rapamycin对mTORC1和mTORC2的抑制作用 | 第22-23页 |
| ·mTORC1信号通路 | 第23-36页 |
| ·mTORC1的上游信号通路 | 第23-28页 |
| ·生长因子 | 第23-25页 |
| ·氨基酸 | 第25-27页 |
| ·能量状态 | 第27页 |
| ·低氧胁迫 | 第27页 |
| ·其它上游信号 | 第27-28页 |
| ·mTORC1活化的分子机制模型 | 第28-29页 |
| ·mTORC1的底物 | 第29-30页 |
| ·mTORC1调控多种细胞功能 | 第30-36页 |
| ·mTORC1与蛋白质合成 | 第30-31页 |
| ·mTORC1与基因转录 | 第31-34页 |
| ·mTORC1与自噬 | 第34-35页 |
| ·mTORC1与细胞周期 | 第35-36页 |
| ·mTORC1与能量代谢 | 第36页 |
| ·mTORC1与衰老 | 第36页 |
| ·mTORC2信号通路简介 | 第36-37页 |
| ·mTORC1与疾病 | 第37-39页 |
| ·组学被用于mTORC1下游功能的相关研究 | 第39-40页 |
| ·结语 | 第40-42页 |
| 第二章 小鼠胚胎成纤维细胞mTORC1调控蛋白的鉴定 | 第42-64页 |
| ·引言 | 第42-43页 |
| ·材料与方法 | 第43-52页 |
| ·实验材料 | 第43-45页 |
| ·细胞系 | 第43页 |
| ·主要试剂 | 第43-44页 |
| ·抗体 | 第43页 |
| ·其它 | 第43-44页 |
| ·主要仪器 | 第44页 |
| ·计算机分析软件 | 第44-45页 |
| ·实验方法 | 第45-52页 |
| ·细胞的处理 | 第45页 |
| ·细胞的裂解 | 第45页 |
| ·丙酮沉淀 | 第45页 |
| ·蛋白质的浓度测定 | 第45-46页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第46页 |
| ·样品中蛋白质浓度的测定 | 第46页 |
| ·十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第46-48页 |
| ·Western blot(免疫印迹) | 第48页 |
| ·蛋白质的溶液内酶解消化 | 第48-49页 |
| ·iTRAQ标记 | 第49页 |
| ·肽段的预分离(SCX-HPLC) | 第49-50页 |
| ·肽段的除盐 | 第50页 |
| ·MALDI-TOF/TOF质谱检测 | 第50页 |
| ·LC-MS/MS分析 | 第50-51页 |
| ·数据库搜索及数据的过滤 | 第51页 |
| ·蛋白的定量分析及功能聚类分析 | 第51-52页 |
| ·实验结果 | 第52-63页 |
| ·mTORC1活化/抑制细胞模型的验证 | 第52-53页 |
| ·定量蛋白质组学研究策略及流程 | 第53-54页 |
| ·蛋白质组学结果的定性分析 | 第54-55页 |
| ·蛋白质组学结果的定量分析 | 第55-56页 |
| ·TSC2调控蛋白的鉴定 | 第56-57页 |
| ·Rapamycin调控蛋白的鉴定 | 第57页 |
| ·mTORC1调控蛋白的确定 | 第57-63页 |
| ·mTORC1调控蛋白的功能聚类分析 | 第63页 |
| ·小结 | 第63-64页 |
| 第三章 mTORC1正调控核转运蛋白质KPNA2的表达 | 第64-84页 |
| ·引言 | 第64页 |
| ·材料与方法 | 第64-70页 |
| ·实验材料(部分同第二章) | 第64-66页 |
| ·细胞系 | 第64页 |
| ·主要试剂 | 第64-65页 |
| ·抗体(部分同2.2.1.2.1) | 第64-65页 |
| ·siRNA | 第65页 |
| ·酶类 | 第65页 |
| ·引物 | 第65页 |
| ·其它(部分同2.2.1.2.2) | 第65页 |
| ·主要仪器(部分同2.2.1.3) | 第65-66页 |
| ·计算机分析软件 | 第66页 |
| ·实验方法(部分同第二章) | 第66-70页 |
| ·细胞裂解液的提取 | 第66页 |
| ·蛋白质的浓度测定 | 第66-67页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第66-67页 |
| ·样品中蛋白质浓度的测定 | 第67页 |
| ·SDS-PAGE(同2.2.2.5) | 第67页 |
| ·Western blot(同2.2.2.6) | 第67页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第67页 |
| ·反转cDNA第一链 | 第67-68页 |
| ·Real-time PCR | 第68-69页 |
| ·RNA干扰实验(RNA interference,RNAi) | 第69页 |
| ·免疫荧光 | 第69-70页 |
| ·实验结果 | 第70-82页 |
| ·mTORC1活化上调多个蛋白质核输入通路中关键蛋白的丰度 | 第70-71页 |
| ·验证mTORC1对KPNA2、RanBP2和RanGAP1的调控 | 第71-79页 |
| ·验证TSC2~(-/-)和Rapamycin对KPNA2、RanBP2和RanGAP1的影响 | 第71-74页 |
| ·免疫荧光检测mTORC1对KPNA2、RanBP2和RanGAP1的影响 | 第74-75页 |
| ·血清诱导mTORC1活化对KPNA2、RanBP2和RanGAP1丰度的影响 | 第75-76页 |
| ·mTORC2对KPNA2、RanGAP1和RanBP2丰度的影响 | 第76页 |
| ·在多种细胞系中检测mTORC1对KPNA2、RanGAP1和RanBP2的影响 | 第76-79页 |
| ·mTORC1调控KPNA2丰度的机制研究 | 第79-82页 |
| ·抑制S6K1不影响KPNA2的蛋白丰度 | 第79-80页 |
| ·敲低4E-BP1不影响KPNA2的蛋白丰度 | 第80-81页 |
| ·mTORC1活化正调控KPNA2的mRNA丰度 | 第81-82页 |
| ·小结 | 第82-84页 |
| 第四章 KPNA2参与mTORC1对糖酵解基因的表达调控 | 第84-94页 |
| ·引言 | 第84页 |
| ·材料与方法 | 第84-86页 |
| ·实验材料(部分同第二、三章) | 第84-85页 |
| ·细胞系(同2.2.1.1) | 第84页 |
| ·主要试剂 | 第84-85页 |
| ·抗体(部分同2.2.1.2.1、3.2.1.2.1) | 第84页 |
| ·siRNA(部分同3.2.1.2.2) | 第84页 |
| ·酶类(同3.2.1.2.3) | 第84页 |
| ·引物(部分同3.2.1.2.4) | 第84-85页 |
| ·其它(同3.2.1.5) | 第85页 |
| ·主要仪器(同3.2.1.6) | 第85页 |
| ·计算机分析软件(同3.2.1.7) | 第85页 |
| ·实验方法(部分同第二、三章) | 第85-86页 |
| ·细胞裂解液的提取(同3.2.2.1) | 第85页 |
| ·细胞质和细胞核组分的分离 | 第85页 |
| ·蛋白质的浓度测定(同3.2.2.2) | 第85页 |
| ·SDS-PAGE及Western blot(同2.2.2.5和2.2.2.6) | 第85页 |
| ·细胞总RNA的提取(同3.2.2.4) | 第85页 |
| ·反转cDNA第一链(同3.2.2.5) | 第85-86页 |
| ·Real-time PCR(同3.2.2.6) | 第86页 |
| ·RNA干扰实验(同3.2.2.8) | 第86页 |
| ·实验结果 | 第86-92页 |
| ·mTORC1活化正调控糖酵解基因的表达 | 第86-87页 |
| ·KPNA2参与mTORC1对糖酵解基因的表达调控 | 第87-88页 |
| ·mTORC1活化正调控HIF1α的表达 | 第88-89页 |
| ·HIF1α参与mTORC1糖酵解基因的表达调控 | 第89-90页 |
| ·敲低KPNA2不影响HW1α的表达及亚细胞定位 | 第90-91页 |
| ·敲低HIF1α不影响KPNA2的表达 | 第91-92页 |
| ·小结 | 第92-94页 |
| 第五章 讨论 | 第94-102页 |
| ·鉴定mTORC1调控蛋白的实验策略 | 第94-95页 |
| ·mTORC1调控多条代谢通路 | 第95-97页 |
| ·mTORC1对蛋白质核输入通路的影响 | 第97页 |
| ·KPNA2在肿瘤细胞中过表达的分子机制 | 第97页 |
| ·mTORC1调控KPNA2表达的分子机制 | 第97-99页 |
| ·mTORC1对RanGAP1/RanBP2和KPNA2的不同影响 | 第99页 |
| ·mTORC1对糖酵解通路的影响 | 第99-100页 |
| ·KPNA2对于研究mTORC1的重要意义 | 第100-102页 |
| 基本结论 | 第102-104页 |
| 参考文献 | 第104-122页 |
| 附表 | 第122-136页 |
| 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第136-137页 |
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