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DNA条形码技术在生物分类中的应用
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【西药学专科毕业论文】作者：韦健红,吴文如,喻良文,林小桦,李薇【摘要】 DNA条形码技术是通过使用DNA序列对物种进行快速、准确识别的技术。目前在动物分类中最常使用的基因序列是线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基(mtCOⅠ)。该技术的出现可以为研究物种的进化规律、遗传变异、系统发育以及生物多样性等提供理论依据。为了让更多非生物分类学研究者了解并将其应用于更多的领域，本文概述了DNA条形码技术的工作流程、技术特点以及在生物分类中的应用和对未来的展望。
【关键词】 DNA条形码;生物分类;线粒体COⅠ基因;物种鉴定;应用分析
)Abstract: DNA barcoding is a taxonomic method that uses a short genetic marker in an organism′s DNA to identify it as belonging to a particular species. Currently,it has been widely used in zoological taxonomy with the part sequence of mitochondrial cytochrome C oxidase subunit Ⅰ (mtCOⅠ). It could provide a theoretical basis for studying the laws of species evolution,genetic variation,phylogeny and biological diversity and so on. The workflow of DNA barcoding,characteristics,applications in biological classification and future prospects,were reviewed in this paper for the researchers in other areas rather than biological taxonomy to learn more and apply the technology in more fields.
Key words:DNA barcode; biological taxonomy; mitochondrial COⅠ gene; species identification;application analysis
继2002年Tautz等[1]提出要用DNA序列作为生物分类系统的主要平台，即DNA分类学后，加拿大Guelph大学的动物学家Paul Hebert[2,3]在2003年就明确提出了DNA条形码(DNA Barcoding)的概念。DNA条形码技术简单地说，就是通过使用一个或一些短的 DNA基因片段作为条形码来对物种进行快速、准确识别的技术。由于该技术具有利用生物种群中的某些遗传保守性很强的DNA片段进行物种鉴定和亲缘关系的定位，了解其分支来源，甚至可以预知其进化方向等诸多用途，使其成为近年来生物分类学家关注的热点。为了让更多非生物分类学研究者熟悉并将其应用于更多的领域，本文概述了DNA条形码技术的主要工作流程、技术特点、在生物分类研究中的应用及争论焦点，并展望了该技术的应用前景。
1 DNA条形码技术主要工作流程
DNA条形码技术所应用的分子生物学技术并不复杂，主要工作流程包括样品采集、DNA提取、设计和合成通用引物、选引物，优化反应条件进行PCR扩增、PCR产物的纯化、序列测定和分析。简单来说，即通过对一组来自不同生物个体的短的同源DNA序列(约800 bp )进行PCR扩增和测序，随后对测得的序列进行多重序列比对和聚类分析，从而将某个体精确定位到某个分类群中。
序列数据分析是DNA条形码探索的最重要环节，首先进行序列比对和人工校正，通过MEGA 或PAUP计算种内和种间的K2P距离(Kimura2parameter distance ) [4]用于表示不同分类阶元之间的序列变异程度，比较种、属和科 3 个水平上的序列差异， 然后根据计算结果建立NJ 树(neighbourjoining tree)，最后依据DNA条形码遗传距离就能对未知标本进行分类和鉴定。
2 DNA条形码的技术特点
DNA条形码技术提供了信息化的分类学标准和有效的生物分类学手段，成为进展最迅速的学科前沿之一。目前它主要应用于生物信息学和分类学领域，该技术具有以下几个特点。
(1)不受发育阶段的影响。同种生物的DNA序列信息在不同的生命周期是相同的，所以该技术检测对象可以是生物生命过程中的每一时期，如虫卵、幼虫、成虫、植物生长的任意生长阶段等，较之传统的方法扩大了研究对象的范围并有利于标准化的实现。
(2)不受个体形态特征的影响。传统分类对各种形态特征齐全的标本的依赖，对于被子植物来说，根据缺少花果的标本，很难正确鉴定。应用DNA条形码技术分类即使当样本受损也不会影响识别结果，而且还能准确地辨别形态相似性很高的物种。
(3)不受物种的限制。一个标准DNA条形码数据库一但建立，可使各种物种的鉴定成为可能，不限于濒危物种、土著物种或入侵种等。
(4)可以鉴定出许多群体中普遍存在的隐存分类单元。
(5)获取信息量大。可通过建立DNA条形码数据库，一次快速鉴定大量样本。
(6)精确性高。DNA条形码技术利用碱基ACTG组成的序列使物种鉴别数字化。这种数据库使得全球范围内的现生物种能够很准确的鉴定出来。这种技术相对于表形标记鉴定方法。分子标记鉴定技术具有更加准确、可靠、客观的特点。
(7)操作方法简便并且高效容易掌握。不要求具备很精准的生物专业技术，便于交叉学科的研究者能很好运用该技术，从而加快生物分类的进程。
3 DNA条形码的应用
作为一种新兴的物种鉴定方法以及上述诸多的优势和特点，使基因条码技术具有巨大的应用潜力，在鉴定物种、发现隐存种、系统发育等生物多样性研究中发挥了极其显著的作用。
3.1 鉴定物种的范围扩大
DNA条码技术已为研究和利用地球上众多的生物资源，鉴定生物多样性提供了强大的工具，目前，DNA条形码已广泛用于各物种的鉴定与分类。Min等[5,6]对Ascomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota的31个真菌物种细胞色素C氧化酶Ⅰ基因(COⅠ)进行了研究，结果显示，约600 bp的COⅠ基因片段长度可以准确进行物种鉴定。陈念等[7]也研究了DNA条形码技术在真菌分类中的应用。研究者们在动物分类和鉴定中的研究也证实了DNA条形码技术的可行性与有效性，潘程莹等[8]研究了斑腿蝗科(Catantopidae)7种蝗虫线粒体COⅠ基因作为DNA条形码来识别蝗虫物种方面的可行性，结果表明,斑腿蝗科3属7种的DNA分类和形态学分类基本一致。高玉时等[9]对我国6个地方鸡种原鸡(Gallus gallus)线粒体COⅠ基因进行了研究，结果证明了COⅠ基因的Bar1序列用于这些品种鉴定是可行的。王中铎等[10]研究了南海常见硬骨鱼类(Teleosts)COⅠ条码序列，结果表明,COⅠ条码序列获取便捷,广泛适用硬骨鱼类物种鉴别,并可用于低级分类阶元的系统进化分析。赵明等[11]利用DNA条形码对蚊类进行研究，结果表明利用DNA条形码信息研制DNA芯片能够鉴定本研究中的15种蚊虫。Ann Bucklin等[12]对北冰洋浮游动物的mtCOⅠ进行了研究，结果表明mtCOⅠ能够对浮游动物的十个物种进行区分和鉴定。植物DNA条形码技术可以用来快速鉴定植物样品和药用植物的研究，石林春等[13] 通过筛选分析，发现ITS2片段适合作为杜鹃属植物的DNA条形码。晁志等[14]建立对生药进行准确鉴定和全面质量评价的二元条形码系统可望为生药的准确鉴定与全面质量评价提供新途径。葛学军研究组[15]在科级水平上利用10种分子标记(atpFatpH、matK、psbKpsbl、rbcL、rpoB、rpoCl、trnHpsbA、rps4、trnLtrnF和ITS2)对藓类植物进行了评价。发现rbcL、rpoCl、trnHpsbA、rps4和tmLfmF可以作为候选的DNA条形码。Nitta等[16]利用rbcL和trnHpsb A组合条形码成功鉴定出膜蕨新种Polyphlebium borbonicum。Kress等[17]研究发现采用ITS和trnHpsbA组合条形码可以区分显花植物。
3.2 隐存分类单元的发现
物种的数目很难确定，原因之一就是我们无法确定大自然还有多少个隐存种，隐存种不是新物种，是指在传统分类法中，没有被划分出来，被归属为同一个物种的不同物种。要知道确切的答案，除非对至少一个分类单元里的物种进行遗传信息分析。DNA条形码技术的出现，成为发现那些形态相似但存在遗传分化的隐种的有效途径，这是对分类学的重要贡献，如巨藻、马达加斯加蚂蚁、澳大利亚鱼等新种就是在利用DNA条形码技术对物种的鉴定过程中发现的。武晓云等[18]在对西花蓟马(Frankliniella occidentalis)rDNA ITS2和COⅠ基因5’末端序列的克隆与比较分析中，得出西花蓟马可能是由两个(或多个)株系或隐存种组成的复合体。Hebert等[20]研究了哥斯达黎加森林中的弄蝶(skipper butterflies)，它们之前被认为属于同一个种 (Astraptes fulgerator Walch)，后来经分析发现这些蝴蝶的DNA 条形码被很清楚地归入了10个不同的组中，表明这些蝴蝶属于10 个不同的种类。AMIR YASSIN等[21]用线粒体DNA作为条形码研究果蝇时，发现两个隐存种Zaprionus africanus 和Zaprionus gabonicus以及一个入侵种Zaprionus indianus。此外对于那些在种水平上形态差异较小且存在不同生活史阶段的物种，如线虫、两栖动物[22] 和群居的社会性昆虫等，用传统方法进行鉴定困难重重，但应用DNA条形码技术则可很好地解决此类问题。
3.3 系统发育关系的探讨
分子系统发育分析是指在分子水平研究物种之间的进化关系，它直接利用从核酸序列或蛋白质分子提取的信息，作为物种的特征，通过比较生物分子序列之间的关系，构建系统发育树，进而阐明各个物种之间的进化关系[23]。建立条形码数据库时，可参照名为生命条形码系统( barcode of life data system， BOLD，http：// www.barcodinglife.org ),该数据库目前已经收录46多万条记录，涵盖了动物界46 000多个物种，并且该数据库在不断扩大。冯思玲[23]介绍了系统发育树构建方法，主要包括基于距离的方法，简约法( MP)，最大似然法 (ML)和 贝叶斯树估计方法。田鹏等[24]对分子系统发育树构建方法进行了简易化。
用于DNA条形编码的COⅠ基因，包含了一定的系统发育信息，可以用于探讨近缘种或种群等低级阶元的系统发育关系。Ward等[25]对澳大利亚273种鱼类的COⅠ基因序列进行分析，认为DNA条形编码不仅可以形成物种鉴定系统，还包含一定的系统发育信息，并对相关种类进行了系统发育研究。诸立新等[26]基于COⅠ基因约640 bp片段序列的遗传距离分析，对尾凤蝶属(Bhutanitis)4种蝴蝶的20只标本进行了鉴定分类，并探讨了分子系统发育关系。张合彩等[27]总结了核基因和线粒体基因在半翅目蚜虫分子系统发育研究中的应用，得出核基因和线粒体基因间以及不同线粒体基因间的联合分析在解决不同层次的问题中均有应用的结论。叶军等[28]基于COⅠ序列构建的系统发育树中鉴定地中海实蝇幼虫的种类。邵爱华等[29]对暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)线粒体DNA 16S rRNA基因克隆、测序，结果表明线粒体DNA 16S rRNA基因适合于研究鲀形目鱼类中属间、不同种间以及分化较早的种间、科级、亚目级的系统发育分析。
4 讨论与展望
DNA条形码操作的简便性和高效性将以我们无法想像的速度加快物种鉴定和进化历史研究的步伐，得到大量生物学从业者支持，但同时也有不少系统学研究者对此持怀疑态度。如DNA条形码技术可以用于植物，但植物DNA条形码的确定仍存在很大争议。由于植物基因组进化较慢，很难确定哪一部分基因片断适合作为识别物种的“条形码”，因此，植物研究进展缓慢。此外，在植物中，谱系偏选和杂交现象更加普遍，无疑增加了筛选DNA条形码的难度，这样就更需要从不同的基因组中选择标识物来保证鉴定的准确度。目前在叶绿体基因组。人们已经在陆地植物中对50多个基因或DNA片段进行了评价，提出了一些备选的条形码(如matK、rbcL、tmHpsbA、trnTL、ycf5和accD)或条形码组合(如matK+rpoB、rpoC+ndhJ、rpoCl+rpoB+matK和rpoCl+matK+trnHpsbA)。Kim等[30]在第二届国际生物条形码大会上提出了 matK+atpFatpH+psbKpbsI或matK+atpFatpH+trnHpsbA两个条形码组合。Fazekas 等[31]采用32 属92 种251份植物材料对这5个组合条形码分析，显示在5个组合的正确识别率在61%～ 69%之间，都不是很高，没有特别理想的组合。此外，争论的焦点还包括如何确定种内和种间的变异范围、COⅠ基因的鉴定力度、物种鉴定是选择单分子标记还是多分子标记等等。
中国拥有数目繁多的动物、植物资源，DNA条形码技术的出现为中国的物种分类学、生物多样性及生物信息学研究等科学领域开辟了一个新的思路。DNA条形码技术被证明是一个行之有效的生物鉴定手段，不仅可以作为传统物种鉴定的强有力补充，更由于它采用数字化形式，使样本鉴定过程能够实现自动化和标准化，它为生态环境建设、生物多样性保护提供全面准确和快速便捷的物种信息服务，突破了传统鉴定方法对经验的过度依赖。有理由相信，DNA条形码技术与其他分类学方法结合使用，能够帮助鉴定物种以及加快发现新种类的速度。
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