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时间分辨荧光法高通量筛选鱼肉组织中土霉素的残留量
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【药学个人简历范文】【摘要】 目的 动物组织中抗生素残留量的测定一般需要多步骤的样品处理过程。本文介绍了一种全新的、简便和快速筛选鱼肉中土霉素残留量的方法。采用固相萃取和时间分辨荧光(time resolved luminescence，TRL)技术，无须离心和过滤，简化了分析过程。方法 将C18小片浸在组织匀浆液中提取和富集20min，取出，在水中浸泡3min，接着浸在TRL试剂溶液中2min，最后取出干燥。干燥后，在C18小片表面上直接进行荧光测定。结果 土霉素在0～8μg/g的范围内，仪器信号的响应与浓度呈现良好的线性关系(γ2=0.9992)，检测限为0.026μg/g，采用本法对45个加标准液的样品(浓度范围在0～4μg/g)进行分析，其中41个样品的定性结果正确，只有4个样品定性结果显假阳性。结论 本方法简便，快速，准确，适用于鱼肉组织中土霉素的高通量筛选分析。
【关键词】 时间分辨荧光； 筛选； 抗生素； 土霉素
ABSTRACT Objective Analysis of antibiotics in animal tissue matrices require multistep sample preparation. A new, easy and rapid method screening the oxytetracycline (OTC) in catfish is developed. It combines sorbent extraction and solidmatrix timeresolved luminescence (TRL) procedures. Without centrifugation and filtration, the analysis process get more easy and rapid. Method Extraction and enrichment are accomplished by immersing small C18 strips into tissues homogenates for 20 min, followed by a 3 min rinse in water and 2 min dip in a reagent solution. After desiccation, TRL is measured directly on the C18 surface. Result The integrated TRL intensity shows a linear dependence on OTC concentration in the 0～8μg/g range (γ2=0.9992) with a 0.026μg/g limit of detection. Among 45 blind samples randomly fortified at 0～4μg/g, 41 were screened correctly and 4 negative samples were presumed positive only. Conclusion The method is simple, rapid and accurate and can be used for high throughout screening of OTC in tissue matrices.
KEY WORDS Timeresolved luminescence; Screening; Antibiotics; Oxytetracycline
土霉素(OTC)是水产养殖中治疗活性气单胞菌属败血症及假单胞菌属败血症的三种常用抗菌药物之一［1］，过度使用可引起土霉素在鱼体中的蓄积并导致细菌的耐药性。美国FDA规定用药后经过21d的消除期后最大残留限度为2ppm。目前，定量测定鱼肉中土霉素应用最多的是高效液相色谱方法， 通过紫外检测［2］、荧光检测［3］或质谱检测［4］进行测定。上述检测方法样品处理步骤繁锁(如匀浆，离心，过滤及固相萃取和净化等)，实验时间长，工作量大，难以用于大批量样品的检验。本文介绍的方法无须离心和过滤，大大简化了样品处理过程，可对大量样品首先进行筛选分析，再对疑似阳性的样品再进行定量分析。
1 仪器和试药
荧光检测仪(瓦里安，Walnut Creek，CA)型号：Cary Eclipse；数据采集及处理软件为Cary Eclipse Lifetime software；试剂及试药均为分析级，购自Aldrich(Milwaukee，WI)；去离子水处理系统为Barnstead Epure system (Dubuque，IA)；匀浆机为UltraTurrax，Janke and Kunkel，Cincinnati，OH)；C18薄层板(200mm×50mm)：购自于Analtech(Newark，DE)，再将其分割为10mm×25mm的小片，然后除保留小片中间6mm×10mm的区域外，其余部分用刀片刮尽，处理后置于干燥箱中备用。土霉素储备液(1mg/ml于甲醇中，冰箱4℃保存)，临用前稀释；TRL试剂为0.5mmol/L Eu(NO3)3∶3.0mmol/L Na2EDTA∶2.5%(w/v)氯化十六烷基三甲基铵(CTAC)的0.15mol/L的tris缓冲液(pH8.5)。
2 实验步骤
2.1 提取和富集
取鱼肉(3.0±0.02)g置50ml聚丙烯离心管中，加入一定量的土霉素标准溶液至一定的浓度(如2ppm)，暗处放置10min，加入7ml的0.01mol/L Na2EDTA溶液后匀浆，再加入0.5ml的20%(w/v)氯化钠溶液，涡旋混匀。从干燥器中取出C18小板，先用少量甲醇润湿其表面，再用清水淋洗，在表面未干之前将其置于匀浆液中，20min后取出，浸没于清水中3min，取出。用纸在板的下边缘处吸去水滴。
2.2 测定
将上述C18小板浸入11ml的TRL试剂中，维持2min。取出后用纸在板的下边缘处吸去水滴，将C18小板置于密闭的干燥器内干燥约30min，直至观察到C18小板表面的颜色由暗转变为亮白色，最后把C18小板固定到样品支架上进行测定。激发和发射波长分别为388和615nm，延迟时间设定为10μs，对0.1～1.0ms之间的信号进行面积积分。
3 结果和讨论
3.1 时间分辨荧光
土霉素结构本身具有荧光性质，并且在与澜系金属Eu(III)形成复合物后能够进行复合物内的能量传递。能量从激发态的土霉素传递到发射态的Eu3+。从图1中看出，土霉素受激发后在388nm处有一个较宽的分子吸收峰，能量传递后，Eu3+在615nm处产生尖峰。能量传递的结果使得产生较大的Stokes位移(约230nm)，提高了仪器检测的灵敏度，更重要的是产生了较长的荧光持续时间(约1ms，图2)。利用时间分辨的特性，在除去可能引起干扰的荧光信号(约数ns的范围)后，对范围在0.1～1.0ms之间的信号进行面积积分后，对土霉素的浓度进行定性分析。我们考察了不同浓度的土霉素与Eu3+结合后产生的信号强度，结果表明，土霉素浓度在0～8μg/g的范围内，仪器信号的响应与浓度呈现良好的线性关系(γ2=0.9992，图3)。
3.2 固相萃取剂及萃取时间的选择
C18对非极性物质具有较强的吸附性，实验［5］证明它可以作为一种较好的吸附剂用于吸附土霉素，并可以直接在它的表面上进行荧光测定。需注意的是在试验中切割薄层板的时候手指尽量不要接触到C18的表面，同时用力应均匀，否则会对实验结果产生较大的影响。我们考察了C18小板在组织液中放置不同时间后的荧光信号(图4，每个浓度点3份平行样测定，图中以均值±SD表示)。
图中虽然在40min时荧光响应最大，但考虑到现场测定要求时间短，同时实验观察到20min时荧光的信号已经足够大并且有较好的重复性，综合以上因素考虑，萃取时间选择了20min。
3.3 检测限
根据国际理论与应用化学家(IUPAC)规定，荧光法检测限的计算按照L=Ks/b计算，式中L：检测限；s：n次空白样品测得值的标准偏差(本实验n=15)；K：置信系数，一般为3；b：标准曲线回归方程中的斜率。 根据3.4中的实验数据， 计算得到检测限为0.026μg/g。
3.4 定性阈值的建立及盲样的测定
阈值的建立对测定结果的判断很重要。阈值如果设定过高，容易产生假阴性；反之，则有较多的疑似阳性的结果。作者对15个空白样品和15个加标样品(浓度为2.0μg/g)进行了分析，结果见图5，图中x和σ分别代表空白样品和加标样品测定信号积分值的平均值和标准偏差。根据统计分析中随机数据正态分布的规律，数据落在(x±σ)、(x±2σ)和x±3σ范围外的几率分别为15.87%、2.27%和0.13%，本实验选取x23σ2作为阈值。为了考察阈值的设定是否合理，我们配制了45个盲样(浓度范围在0～4μg/g)，测定结果见表1。所有21个阳性样品(指添加标准浓度大于/等于2μg/g)全部检出，在24个阴性样品(指添加标准浓度小于2μg/g)中有4个样品检出结果为疑似阳性，数据分析这4个样品的加标样后浓度均接近了2.0μg/g(4个样品的加标浓度在1.91～1.97μg/g之间)。由此得出，本方法具有很大的实际应用价值。
3.5 展望
尽管本方法作为一种高通量的定性筛选方法，但根据在0～8μg/g的范围内，仪器信号的响应与浓度呈现良好的线性关系，检测限为0.026μg/g，并且加标盲样的测试结果较为满意，是否可以直接用做定量测定将进一步考察。
4 小结
本方法采用组织液中直接萃取的提取方法，吸收了固相萃取的优点，同时避免了目前常规检验方法中离心和过滤等步骤，并且不使用有机溶剂，降低了对实验人员及环境的危害。通过专属性极强的OTCEu3+复合物内能量传递所具有的时间分辨技术与固相萃取技术的联用，快速的对鱼肉组织体内的OTC进行筛选，配合便携式荧光测定仪更可进行现场测定。
【参考文献】
［1］ Plumb A J. Talapia bacterial diseases in health maintenance and culture of microbial diseases of cultured fishes ［J］. Iowa State Univ Press Ames,IA,1999,41～67.
［2］ Meinertz J R, Stehly G R, Gingerich W H. Liquid chromatographic determination of oxytetracycline in edible fish fillets from six species of fish ［J］. J AOAC Int,1998,81:702～708.
［3］ Agasoster T, Rasmussen K E. Online dialysis, liquid chromatography and postcolumn reaction detection of oxytetracycline in salmon muscle extracts ［J］. J Pharm Biomed Anal,1992,10:349～354.
［4］ Oka H, Ito Y, Ikai Y, et al. Mass spectrometric analysis of tetracycline antibiotics in foods ［J］. J Chromatogr A,1998,812:309～319.
［5］ Lin Shu Liu, Guoying Chen, Marshall L, et al. A single sorbent for tetracycline enrichment and subsequent solidmatrix timeresolved luminescence ［J］. Anal Chim Acta,2005,528:261～268.
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