logo
教育论文中心  教育论文中心   广告服务  广告服务   论文搜索  论文搜索   论文发表  论文发表   会员专区  会员专区   在线购卡   在线购卡   服务帮助  服务帮助   联系我们  联系我们   网站地图  网站地图   硕士论文  会员专区   博士论文
当前位置:教育论文中心首页--现代农业新技术论文--从固定液保存的刺参样品中提取基因组DNA的效果研讨
推荐论文
蝇蛆抗菌肽对鳙鱼生长性能的发展因
南方丘陵山区柑桔生态系统研究的理
研讨环境研讨信息分析处理研究
综合集成研讨人机结合研讨
综合集成研讨环境决策研讨模型
异养小球藻保种技术研究与应用
关于韩传统寺观壁画壁画保存
样品买卖样品存在隐蔽瑕疵
战争设计工程专家研讨组织与共
基于综合集成研讨网络银行安全
北方工厂化刺参养殖技术
协商研讨系统可视化技术研究
当归六黄汤分煎样品与合煎样品
当归六黄汤分煎样品与合煎样品中黄
当归六黄汤分煎样品与合煎样品
基于关联规则研讨信息分析研究
 
站内搜索
 
 
科目列表
市场营销 管理理论 人力资源
电子商务 社会实践 先进教育
伦理道德 艺术理论 环境保护
农村研究 交通相关 烟草论文
电子电气 财务分析 融资决策
电影艺术 国学论文 材料工程
语文论文 数学论文 英语论文
政治论文 物理论文 化学论文
生物论文 美术论文 历史论文
地理论文 信息技术 班主任
音乐论文 体育论文 劳技论文
自然论文 德育管理 农村教育
素质教育 三个代表 旅游管理
国际贸易 哲学论文 工商管理
证券金融 社会学 审计论文
会计论文 建筑论文 电力论文
水利论文 园林景观 农林学
中医学 西医学 心理学
公安论文 法学法律 思想汇报
法律文书 总结报告 演讲稿
物业管理 经济学 论文指导
计算机 护理论文 社会调查
军事论文 化工论文 财政税收
保险论文 物流论文 语言教育
教育教学 给水排水 暖通论文
结构论文 综合类别 硕士论文
博士论文    
 
 
 
从固定液保存的刺参样品中提取基因组DNA的效果研讨

【现代农业新技术论文】刺参(Apostichopus japonicus)分类学上隶属于棘皮动物门、游走亚门、海参纲、楯手目、刺参科,是重要的经济海参物种[1]。刺参含有丰富的蛋白质、酸性黏多糖、维生素、氨基酸、海参皂苷以及多种微量元素和生理活性物质,具有很高的营养、保健和药用价值。其中以产于我
.Kkg291 { display:none; }
刺参(Apostichopus japonicus)分类学上隶属于棘皮动物门、游走亚门、海参纲、楯手目、刺参科,是重要的经济海参物种[1]。刺参含有丰富的蛋白质、酸性黏多糖、维生素、氨基酸、海参皂苷以及多种微量元素和生理活性物质,具有很高的营养、保健和药用价值。其中以产于我国辽宁、山东沿海的刺参营养、药用价值最高。随着人们生活水平的提高,刺参市场需求量显著增加。20世纪80年代以来,随着海洋经济快速发展,我国刺参增养殖随之迅猛发展,已经形成了产业化。据不完全统计,我国刺参产量产值每三至五年翻一番。目前,刺参的年产量已接近20万吨,产值达到300亿元以上,刺参已经成为我国水产业单种产值最高的经济物种之一。
随着刺参养殖产业的发展,必须加强刺参生物学特性、遗传多样性、功能基因的开发与利用等等方面的研究,才能科学开展刺参新品种的培育与健康养殖。在科研工作中,以PCR技术为核心的分子标记技术如限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、微卫星(SSR)、单核苷酸多态性(SNPs)等遗传信息的分析在水产动物遗传育种、遗传多样性研究等方面已经得到广泛应用。为获得高质量的刺参基因组DNA,冯志纲等(2008)和孙孝德等(2010)进行了刺参基因组DNA提取方法的探讨,但他们都是采用活体刺参即时采样,即时提取[2-3]。而在实际科研工作中,科研工作者往往需要到刺参养殖场进行采样,通过将刺参样品保存在70%的乙醇固定液中带回实验室。常规的酚-氯仿抽提法虽然适用于各种动物组织DNA的提取,简单易行,一般实验室即可操作,但由于刺参含有丰富的黏多糖和蛋白质[4],所以该方法应用于刺参DNA提取时效果并不理想。本研究优化与改进了酚-氯仿抽提法对适应70%乙醇固定保存的刺参组织样品中基因组DNA的提取,为获得高质量刺参基因组DNA提供方法保障。
1 材料及方法
1.1 样品采集
实验所用刺参取自大连某养殖场,用70%乙醇[5]固定刺参体壁后带回实验室于-20 ℃保存备用。
1.2 常规的酚-氯仿抽提法提取刺参基因组DNA
常规酚-氯仿抽提法见参考文献[6]。
1.2.1 样品处理 取保存在70%乙醇中的刺参体壁样品约0.2~0.4 g,用滤纸将酒精尽可能地吸干,放入灭菌的1.5 mL离心管,用剪刀剪碎。
1.2.2 水浴 向1.5 mL离心管中加入600 μL DNA提取液(10 mmol/L Tris-Cl,0.1 mol/L EDTA,0.5% SDS)和蛋白酶K(20 mg/mL)至终浓度100 μg/mL后充分混匀,放入恒温55 ℃水浴锅中消化,水浴时每隔15 min翻转一次,直到消化完全。
1.2.3 萃取 将溶液冷却至室温,①加入等体积的用0.1 mol/L Tris-Cl(pH 8.0)平衡过的苯酚。将离心管置于旋转器上,使离心管缓慢颠转10 min以温和地混合两相。12 000 r/min,离心15 min,分离两相。②取上清,加入苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合液轻柔混匀10 min,以12 000 r/min,离心10 min。③取上清,加入等体积氯仿轻柔混匀10 min,以12 000 r/min,离心10 min。 简历大全 /html/jianli/
1.2.4 沉淀DNA 在取出的上清液中加入2倍体积的-20 ℃预冷的无水乙醇,充分混匀后放在-20℃冰箱中2 h,然后以12 000 r/min,离心15 min,弃上清。
1.2.5 洗盐 加入70%乙醇500 μL洗涤,12 000 r/min,离心5 min,弃上清后重新6 000 r/min离心5 min。取出离心管倒置在滤纸上数分钟,吸干剩余液体。
1.2.6 溶解DNA 加入200 μL 1×TE以及2 μL RNA酶轻弹混匀后,放置于4 ℃过夜备用。
1.2.7 检测 制备1%的琼脂糖凝胶,用EB显色,3 μL的DNA模板与3 μL的6×Loading buffer混匀上样,120 V电泳20 min,电泳结果经凝胶成像显示DNA的质量,用微量核酸蛋白检测仪(NV3000)测定DNA的纯度与浓度。
1.3 改进的刺参基因组DNA提取方法
将1.2.2中裂解液EDTA的浓度提高了10倍,为1 mol/L。
将1.2.3中①加入等体积Tris-平衡酚调整为酚/仿6:1(v/v)。将1.2.3中②、③步中苯酚/氯仿/异戊醇、氯仿混匀时间缩短为5 min。将12.3萃取后增加3次氯仿抽提次数。
1.4 DNA提取试剂盒
应用天根生化科技有限公司DNA提取试剂盒,按照说明书的方法对70%乙醇保存的刺参样品进行基因组DNA提取。
1.5 PCR扩增 开题报告 /html/lunwenzhiDao/kaitibaogao/
1.5.1 微卫星位点选择 选取刺参微卫星序列(GenBank No.EF032102),设计引物,扩增的目的片段大小为237bp。 上游引物序列:5′–TCCGACTTTTAGGACCAGAT–3′;下游引物序列:5′–TGGGTTTTCACCTCAGACG–3′。
1.5.2 PCR反应体系 25 μL体系,包括10×PCR buffer(Mg2+ Plus)2.5 μL,dNTP 2μL;上、下游引物(10 M)各2 μL,DNA模板1 μL,TaqE(5 U/μL)0.5 μL;ddH2O 15 μL。
1.5.3 PCR扩增程序 94 ℃预变性5 min;进行如下26个循环:94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s;72 ℃延伸7 min。
2 结果与讨论
本研究采用常规的酚-氯仿抽提法、改进方法和公司试剂盒的三种方法对70%乙醇保存的刺参体壁组织样品进行基因组DNA的提取,DNA提取结果见图1。由图1可见,常规的酚-氯仿法和试剂盒提取的DNA,从琼脂糖凝胶电泳图可以看出提取的基因组DNA有降解、凝胶孔中存在大分子杂质。而改进的酚-氯仿法提取的DNA,从琼脂糖凝胶电泳图可以看出提取的基因组DNA条带清晰、整齐,说明提取的基因组DNA分子较完整、无杂质、基本没有降解。经微量核酸蛋白检测仪测得常规的酚-氯仿法和试剂盒提取的基因组DNA在260 nm和280 nm的光密度值的比值(A260/A280)分别为1.26和149,远远小于1.8,说明DNA中有蛋白等杂质的存在;而改进的酚-氯仿法法提取的基因组DNA的A260/A280为1.89,在理想值范围。常规的酚-氯仿抽提法提取的DNA浓度为404 μg/mL,试剂盒法提取的DNA浓度为319 μg/mL,改进的酚-氯仿法法提取的基因组DNA的浓度为389 μg/mL。 代写论文
(a常规的酚-氯仿方法、b为试剂盒方法、c改进的酚-氯仿方法)
分子标记技术是建立在PCR基础之上的,而模版DNA的质量又是影响PCR扩增的关键因素。因此如何得到更高质量的刺参基因组DNA至关重要。尽管有以活体取管足等组织提取刺参基因组DNA,但对于保存在70%乙醇中的刺参样品提取高质量DNA 总结大全 /hTml/zongjie/

的报道文献不多。经过多次反复应用常规的酚-氯仿法和试剂盒进行刺参基因组DNA的提取,提取的效果很不理想,这主要是由于刺参体内黏多糖和蛋白质含量相当丰富。本文针对刺参的生物学特点,在对刺参组织样品进行消化时
.Svn358 { display:none; }
的报道文献不多。经过多次反复应用常规的酚-氯仿法和试剂盒进行刺参基因组DNA的提取,提取的效果很不理想,这主要是由于刺参体内黏多糖和蛋白质含量相当丰富。本文针对刺参的生物学特点,在对刺参组织样品进行消化时,将裂解液中EDTA的浓度提高了10倍。因为EDTA具有拆解蛋白质的能力,这就分担了后面酚仿萃取时的压力。同时,针对刺参DNA提取过程中极易降解的特点,我们改变了酚仿抽提时间和次数。本实验的结果表明:以改进的酚-氯仿法提取的刺参基因组DNA,其A260/A280比值理想;从SSR-PCR扩增结果来看,以改进的酚-氯仿法提取的刺参基因组DNA为模版扩增的PCR产物效果更好。
参考文献:
[1] 王颖,仇雪梅,王娟,王秀利.刺参病害现状及其生物技术检测的研究进展[J].生物技术通报,2009 (11): 60-64
[2] 冯志纲,于佳平,丁君,等.仿刺参基因组 DNA 提取方法改进[J].生物技术通报 (S1): 2008年增刊:352-355
[3] 孙孝德,孙国华,杨建敏,等.刺参基因组 DNA 提取的探讨[J].生物技术通报,2010(3):149-153
[4] 苏秀榕,娄永江,常亚青,等.海参的营养成分及海参多糖的抗肿瘤活性的研究[J].营养学报,2003,25(2): 181-182
[5] 刘保忠, 宋林生,相建海.海湾扇贝样品不同保存条件下 DNA 的提取及 RAPD 扩增比较[J].海洋科学,2001, 25(3): 51-53
作文 /zuowen/


 
 
 
 您可能感兴趣的论文
论文标题页/字数分类
基于多文档摘要研讨文本分析方法及应用49页硕士论文
用于区域规划问题求解综合集成研讨厅系统设计与实现78页硕士论文
生物样品生物碱检测样品前处理技术研究83页硕士论文
复杂样品杀菌剂残留分析样品前处理技术研究56页硕士论文
HWME“广义专家”群体网络研讨过程链接结构及其分析算法研究62页硕士论文
大学本科课堂研讨式教学研究64页硕士论文
人教版高中语文必修散文单元“研讨与练习”教学研究43页硕士论文
高中语文教科书(必修)“研讨与练习”研究--以现行人教版为例44页硕士论文
地方高校“新生研讨课”模式与管理研究--以广西大学为例77页硕士论文
现行人教社高中语文教科书(必修)“研讨与练习”部分研究47页硕士论文
教师工作坊主题研讨活动设计与应用研究89页硕士论文
中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)精子低温保存研究64页硕士论文
大腹圆蛛基因组DNA文库构建及其拖丝蛋白基因杂交筛选74页硕士论文
人类子宫组织短期冷缺血保存研究61页硕士论文
刺参菌群结构分析及益生菌对刺参影响123页博士论文
微波法快速提取丝状真菌基因组DNA1944字期刊论文
IVF出生小鼠及其后代基因组DNA甲基化修饰变化研究149页博士论文
桑种质资源随机扩增多态性DNA(RAPDs)及叶绿体基因组DNA68页硕士论文
枸杞基因组DNA提取及指纹图谱分析4327字期刊论文
加压环境下采用不同保存方法及自制FM保存对羊关节软骨及半月板保存70页硕士论文
等离子体质谱氧气碰撞池技术测定复杂基体样品痕量砷和硒2929字期刊论文
原子吸收法测定化探样品钴、镍1850字期刊论文
影响测定化探样品主要因素讨论1129字期刊论文
全自动还原糖测定仪测定熟地样品还原糖含量1917字期刊论文
当归六黄汤分煎与合煎样品阿魏酸含量比较2491字期刊论文
血小板单采样品残留白细胞计数两种方法评价1618字期刊论文
南药高良姜基因组DNA提取方法研究3491字期刊论文
 
 
| 会员专区 | 在线购卡 | 广告服务 | 网站地图 |
版权所有 教育论文中心 Copyright(C) All Rights Reserved
联系方式: QQ:277865656 或写信给我