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补脾益气方药对脾虚哮喘大鼠肺组织IκB/NF-κB信号途径的影响
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【西医学社会实践论文】【摘要】 目的 探讨脾虚型哮喘大鼠气道炎症,血液和支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞百分比,肺组织核因子-κB抑制蛋白α(IκB α)表达和核因子-κB(NF-κB)活性的变化及补脾益气方药对其的影响。方法 将30只雄性Wistar大鼠随机分为3组：正常对照组(A组)、脾虚型哮喘组(B组)、补脾益气方药组(C组),采用HE染色检测肺组织病理变化,采用免疫组织化学方法检测肺组织IκB α表达水平和NF-κB p65的活性变化。结果 B组与A组比较,肺组织IκB α表达显著降低,而NF-κB p65的活性显著增高(P＜0.01)；C组与B组比较,肺组织IκB α表达显著增高,而NF-κB p65的活性显著降低(P＜0.01)。结论 补脾益气方药能有效增加脾虚型哮喘大鼠肺组织IκB α的表达,抑制其肺组织NF-κBp65的活性,减轻哮喘时的气道炎症变化,从而对脾虚型哮喘起到治疗作用。
【关键词】 脾虚；哮喘；核因子-κB抑制蛋白α；核因子-κB；大鼠
Abstract: Objective To investigate airway inflammation, number of eosinophils in blood and BALF, the expression of inhibitor protein α (I κB α) and nuclear factor-κB (NF-κB) activity in lung of rat with spleen deficiency asthma, and the effect of herbs of reinforcing spleen to replenishing Qi. Method Thirty rats were randomly divided into three groups：control group (group A), spleen deficiency asthma group (group B), decoction group (group C). The pathological changes of lung was detected by HE staining, and the expression of I κB α and activity of nuclear factor κB p65 (NF-κB p65) was assessed in lung by immunohistochemistry. Results Compared with group A, the expression of I κB α significantly reduced (P＜0.01) in group B, and activity of NF-κB p65 significantly increased (P＜0.01). Compared with group B, the expression of I κB α was significantly increased, and activity of NF-κB p65 was significantly lowered in group C (P＜0.01). Conclusion Herbs of reinforcing spleen to replenishing qi can effectively played treatment of asthma in rats of spleen deficiency by increasing lung tissue I κB α expression, inhibiting NF-κB p65 activity and reducing airway inflammation.
Key words：spleen deficency；bronchial asthma；I κB α；NF-κB；rat
在临床实践中,许多医家遵循：哮病主治在痰、根治在脾的原则,多采用补脾益气方药治疗,通过补脾气而益肺气。本课题组前期研究表明,补脾益气方药可以显著降低哮喘大鼠支气管上皮细胞粘附分子(ICAM-1),肺泡灌洗液(BALF)中内皮素-1和肿瘤坏死因子(TNF-α),血清白介素-4(IL-4)的含量,而升高血清干扰素-α的含量,从而改善了气道炎症,降低了气道高反应[1-2]。而核因子-κB抑制蛋白IκB α/核因子-κB(IκBα/ NF-κB)信号转导途径与哮喘时多种炎性因子的表达和调控密切相关,因此,本研究进一步从该信号转导途径入手,研究补脾益气方药改善哮喘时气道炎症的机制。
1 材料与方法
1.1 动物和分组
清洁级雄性Wistar大鼠30只,体重（200±20）g,中国医
科大学实验动物部提供。按照随机数字法分成3组：正常对照组(A组)、脾虚型哮喘组(B组)、补脾益气方药组(C组)。
1.2 药物和试剂
实验用药材由辽宁中医药大学附属第一医院提供,冷水浸泡30 min,常规煎煮2次,合并药液,浓缩至为1 mL/g原药材。卵蛋白(OVA, GradeⅡ,sigma A5253)；IκB α兔抗大鼠多克隆抗体,NF-κB p65兔抗大鼠多克隆抗体,多聚赖氨酸,SABC试剂盒,DAB显色剂(武汉博士德生物工程有限公司)。
1.3 仪器
RM2235型手动石蜡切片机,EG1150C型包埋机,HI1210摊片机,HI1220型烘片机(德国LEICA),XS-213型JNOEC生物显微镜BX51(南京江南光电集团股份有限公司),BX51型OLYMPUS反射荧光显微镜(日本OLYMPUS)。
1.4 脾虚哮喘大鼠模型的建立和评价
1.4.1 脾虚模型的建立
B、C组参考李氏[3]的方法改进,采用饮食不节、疲劳过度和苦寒泻下等多因素作用建立脾虚模型,然后利用卵蛋白分致敏和激发两阶段建立哮喘模型。饮食不节：单日只喂饲甘蓝10～15 g/只,双日以猪油3 mL/只灌胃,正常饮食,时间10 d。疲劳过度：在上述处理当日放入27 ℃水池中,游泳至耐力极限(耐力极限指大鼠游泳至无力游动,经驱赶仍不能继续,且出现身体向腹侧曲、发抖、欲溺水等征象)。苦寒泻下：单日以100%大黄灌胃2 mL/只。在造模结束时,大鼠出现体重下降、消瘦、食量减少、饮水增多、肛温升高、倦怠少动及游泳耐力下降等改变,符合脾虚证标准,表明脾虚模型制做成功。
1.4.2 哮喘疾病模型的建立
致敏：B、C组动物脾虚证模型建立成功后,在实验第11、13、15日,以抗原液1 mL(含OVA 100 mg,灭活百日咳杆菌疫苗5×109个,氢氧化铝干粉100 mg)腹腔注射致敏。激发：致敏后第15日,以1%卵蛋白溶液用超声雾化器喷雾激发。喷雾由事先放入雾化箱内的动物自行吸入激发。每次喷雾30 min,连续7 d。C组动物在脾虚造模成功后,1 mL/100 g体重中药灌胃治疗,每日1次,共22 d。
1.5 一般状态观察
脾虚造模过程中观察大鼠体重、食量、饮水量和肛温的变化及运动情况、游泳情况等。哮喘造模时观察大鼠呼吸频率、腹肌运动情况等。
1.6 肺组织病理学观察
末次激发后,20%乌拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠,迅速开胸,结扎并取出右肺下叶,用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋。常规石蜡切片脱蜡致水,苏木精染色5～10 min,自来水洗5 min, 1%盐酸乙醇分化3～5 s,自来水充分洗涤30 min以上,0.5%伊红酒精染色1～2 min,脱水透明,中性树胶封片,光镜下观察。
1.7 血和肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞检测
末次激发后,20%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠,眶静脉取血0.1 mL,进行血液涂片。开胸结扎并取出右肺下叶后,用注射器将2 mL生理盐水缓慢注入气管和左侧肺中,立即缓慢抽回,反复3次,离心分离上清液与细胞沉淀,细胞沉淀用1 mL PBS液重悬,取0.1 mL重悬液涂片。涂片染色,在显微镜下计数100个白细胞中嗜酸性粒细胞数目为嗜酸性粒细胞百分比。
1.8 大鼠肺组织IκBα和NF-κB p65的测定
肺组织石蜡切片常规脱蜡至水,采用免疫组化(streptavidin biotin complex)法进行测定,3%H2O2室温处理10 min灭活内源性酶,蒸馏水洗3次,滴加复合消化液5 min,蒸馏水洗3次,滴加5%BSA封闭液,室温20 min,甩去多余液体,滴加一抗(1∶100稀释),4 ℃过夜,PBS洗3次,每次2 min,滴加生物素PBS,洗4次,每次5 min,DAB显色,蒸馏水洗涤,苏木素轻度复染,脱水,透明,封片。图像分析：IκBα阳性表达在细胞质,NF-κB p65阳性表达细胞在细胞核。显微镜观察肺内支气管部位,每张切片随机选取5个高倍视野(×400),分别测定IκBα阳性表达的光密度和计算NF-κB p65细胞核阳性的细胞数占总细胞数的百分比,取其平均值作为该切片的代表值。
1.9 统计学方法
实验数据运用SPSS13.0处理,以x±s表示实验结果,进行多组数据的方差分析,组间比较采用LSD法,相关性分析采用Pearson相关性分析。P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 一般状态和体重变化
脾虚造模结束时大鼠体重下降,食量明显减少,饮水量增多,肛温升高,运动减少,游泳耐力下降,符合脾虚模型标准,表示脾虚模型建立成功。卵蛋白溶液喷雾激发时大鼠出现呼吸急促、烦躁、点头、腹肌抽动等症状表示哮喘造模成功。
2.2 肺组织病理学变化
B组支气管管壁和伴行动脉周围有较多的嗜酸性粒细胞,单核细胞和淋巴细胞浸润,并且支气管黏膜皱壁增多、延长,气管管腔缩小,杯状细胞增生,基底膜增厚,气道腔内可见炎性分泌物,有的小支气管被黏液栓和炎性细胞所闭塞。A组支气管管壁和伴行动脉周围无炎性细胞浸润,支气管管腔光滑,无炎性分泌物。C组有轻度的炎症改变,但与脾虚型哮喘组比较明显减轻。
2.3 血和肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞百分比计数结果
(见表1)表1 各组大鼠血和BALF中嗜酸性粒细胞百分比比较(略)注：与A组比较,*P＜0.01；与B组比较,#P＜0.01(下同)
2.4 大鼠肺组织核因子-κB抑制蛋白α表达变化
免疫组化结果显示,IκBα主要表达在支气管上皮细胞部位,脾虚型哮喘组大鼠气道壁IκBα阳性表达明显低于A组,而C组明显高于B组。结果见表2。
2.5 大鼠肺组织核因子-κB p65表达变化
免疫组化结果显示NF-κB p65表达在支气管上皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞等部位,A组大鼠支气管上皮细胞有少量NF-κB p65阳性表达,B组大鼠支气管上皮细胞NF-κB p65阳性表达明显增多(P＜0.01),而C组与B组比较明显减少(P＜0.01)。结果见表2。表2 各组大鼠肺组织IκBα阳性表达光密度和NF-κB p65阳性细胞 数比例的比较(略)
3 讨论
哮喘是一种由多种炎性细胞和细胞因子参与的慢性气道炎症性疾病,多种炎性因子在哮喘时表达增高,而NF-κB作为一种转录因子,参与了多种炎性因子的转录调节,在哮喘的发病机制中发挥重要作用[4]。NF-κB是由Rel、RelB、p65、p50和p52等5种蛋白组成的一个家族[5],在体内发挥生理功能的主要是p50和p65两个亚基构成的异源二聚体,其中p50亚基的主要功能是与基因启动子和增强子特异性结合,p65亚基的主要功能是增强靶基因的转录激活。在细胞静息状态下,p50-p60异源二聚体和IκB结合形成三聚体存在于细胞质中,IκB家族IκBα、IκBβ、IκBγ、Bcl-3、p100和p105,其中IκBα是IκB家族中的最重要成员,其磷酸化和降解作用是NF-κB激活的共同途径[6]。在哮喘气道中,过敏原、鼻病毒感染、巨噬细胞和炎症细胞释放的前炎症细胞因子等增加炎症的刺激均p50-p60异源二聚体与IκBα解离,导致NF-κB被激活进入细胞核,引起TNF-α、IL-8和ICAM-1等炎性因子的过度表达,在哮喘气道炎症反应中起决定性作用。本研究结果显示,脾虚型哮喘大鼠与A组比较,肺组织IκBα表达水平显著降低,而NF-κB p65的活性显著增加,说明脾虚能够使肺组织IκBα表达降低,从而使NF-κB p65的活性增加,引起相关性的炎症基因过度表达,加重了哮喘时的气道炎症反应。而补脾益气方药能够诱导IκBα表达,抑制肺组织NF-κB p65的活性,从而减轻了气道炎症,可能是其对哮喘起到防治作用的重要机制之一。
【参考文献】
[1] 李 刚,柳 春,魏庆宇.补脾益气方药对哮喘大鼠血清白细胞介素-4和γ-干扰素含量的影响[J].世界科学技术——中药现代化,2000,2(4)：37－38.
[2] 李 刚,柳 春,魏庆宇.补脾益气方药对哮喘大鼠支气管肺泡灌洗液中内皮素-1及肿瘤坏死因子的影响[J].中国中医基础医学杂志,2000,6(2)：22－24.
[3] 李德新,王晓明,易 杰,等.脾虚证对生物膜结构与功能影响的实验研究[J].辽宁中医杂志,1993,20(6)：39.
[4] Lee SH, Seo MJ, Choi SM, et al. DA-9201 shows antiasthmatic effects by suppressing NF-kappaB expression in an ovalbum induced mouse model of asthma[J]. Arch Pharm Res,2005,28(12)：1350－1357.
[5] Orange JS, Levy O, Geha RS. Human disease resulting from gene mutations that interfere with appropriate nuclear factor-kappaB activation[J].Immunol Rev,2005,203：21－37.
[6] Hoffmann A, Levochenko A, Scott ML, et al. The IκB-NF-κB signaling module：temporal control and selective gene activation[J]. Science,2002,298(8)：1241－1245.
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