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重组人肝脏胶原样凝集素1在中国仓鼠卵巢细胞内定位
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【中医学论文集】作者：李付广, 杨桂枝, 王芳, 杜英【摘要】 目的: 使用已构建的真核表达载体pEGFPCLL1转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞, 探讨CLL1在CHO细胞内的定位。方法: 使用免疫荧光标记技术和Western blot检测EGFPCLL1融合蛋白在细胞内的表达部位。结果: 融合蛋白主要存在于细胞质基质中, 不存在于内质网、 高尔基体和细胞核等部位。结论: CLL1为已发现惟一存在于细胞质基质中的胶原样凝集素成员。
【关键词】 肝脏胶原样凝集素1 蛋白定位 绿色荧光蛋白 高尔基体 内质网
人肝脏胶原样凝集素1（collectin liver 1, CLL1）是Ohtani等克隆和鉴定出的一个胶原样凝集素家族的新成员[1], 编码基因位于8q23q24.1, 由6个外显子和5个内含子组成, 其cDNA中含有831 bp编码片段, 可编码277个氨基酸序列, 推测该序列具有典型的胶原样凝集素特点, 由N端富含半胱氨酸区、 胶原样区、 颈区和糖识别区（carbohydrate recognition domain, CRD）组成。其他胶原样凝集素成员多数为分泌蛋白, 存在于血液和组织液中, 是固有免疫的重要分子, 它们通过激活补体, 凝集病原微生物, 抑制病原生长, 调理和激活吞噬作用等参与机体的免疫防御反应[2, 3]。但对CLL1的在人体组织分布和细胞内定位及其功能了解较少。我们尝试利用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞真核表达系统表达重组人CLL1, 并检测该蛋白在细胞内的定位。
1 材料和方法
1.1 材料 pEGFPC1载体购自Clontech公司; CHOK1细胞系购自ATCC; 大肠杆菌DH5α为本室保存。工具酶均购自宝生物公司（大连）; HAM/F12培养液购自Hyclone公司; 胎牛血清购自天津市TBD生物技术发展中心; 多聚甲醛（paraformaldehyde, PFA）、 聚乙烯亚胺 (polyethylenimine, PEI)购自Promega公司; ERTracker BlueWhite DPX和BODIPY TR C5Ceramide购自Molecular Probes公司; ECL plus Western blot检测试剂购自Amersham Biosciences公司。
1.2 方法
1.2.1 真核表达载体pEGFPCLL1的构建 使用本室已构建好的含有人全长CLL1 cDNA的真核表达载体pEGFPCLL1, 通过酶切鉴定和序列分析, 表明插入目的片段DNA序列与读码框完全正确。
1.2.2 细胞培养和转染步骤 将CHOK1细胞按1∶4转种于直径35 mm的玻璃底Petri平皿（MatTek）内, 完全生长培养液为含2 mmol/L L谷氨酰胺、 100 mL/L胎牛血清（FCS）和1.5g/L碳酸氢钠的Ham’s F12K培养液, 放置37℃含50mL/L CO2的饱和湿度空气中孵育。把1 μg质粒DNA溶于100 μL不含血清的Ham’s F12K培养液, 加入适量PEI振荡混均, 室温孵育20 min, 形成PEI/DNA复合物（polyplex）; 再加入完全生长培养液至终体积1000 μL混均; 当CHOK1细胞贴壁生长70%形成单层细胞, 将培养皿中培养液吸出, 用PBS冲洗2次, 将含有转染复合物的1000 μL培养液一滴一滴地加入培养皿, 边加边摇动[4]。细胞培养6 h后, 去除转染液, 换完全培养液继续培养42 h, 荧光染色。
1.2.3 荧光标记方法 用内质网特异性荧光染料ERTracker BlueWhite DPX, 对转染后的细胞染色, 探针的染色步骤按照试剂说明书进行: 将1 mmol/L ERTracker BlueWhite DPX储备液稀释至0.5 μmol/L的工作液, 在玻璃底Petri平皿的中间凹槽中加入100 μL含0.5 μmol/L的染料的无血清培养液, 37℃放置30 min, 用无探针的培养液替代染液。特异显示高尔基体红色荧光探针BODIPY TR C5Ceramide染色方法如下: 用无血清培养液冲洗培养细胞3次, 加100 μL含5 μmol/L BODIPY TR C5Ceramide染液, 4℃孵育30 min, 用冰冷培养液冲洗3次, 加200 μL新鲜培养液37℃继续孵育30 min, 吸出液体弃去, 加1滴抗褪色溶液, 用盖玻片盖上细胞, 在BX51TRF荧光显微镜下观察和图像采集。330～385 nm激发观察ERTracker BlueWhite DPX发出的蓝色荧光(滤光片BA420), 460～490 nm激发观察EGFP融合蛋白发出的绿色荧光(BA510IF), 545～580 nm激发观察BODIPY TR C5Ceramide发出的红色荧光(滤光片BA610IF), 图象重叠观察EGFP融合蛋白细胞内定位。
1.2.4 Western blot分析 按文献[5]方法制备转染细胞的细胞质基质部分和细胞核、 高尔基体、 内质网部分, 免疫沉淀法浓缩培养上清中的EGFP或EGFP融合蛋白（抗EGFP mAb）, SDSPAGE电泳, 转印到PVDF膜, 兔抗EGFP多抗为一抗, 羊抗兔IgGHRP为二抗, ECL PLUS化学发光试剂为检测系统, 进行蛋白质Western blot分析。
2 结果
2.1 EGFPCLL1融合蛋白在CHO细胞内的定位 重组质粒pEGFPCLL1瞬时转染CHO细胞, 转染阳性细胞表达融合蛋白EGFPCLL1, 发绿色荧光, 广泛分布于细胞质内（图1C）; 红色荧光示踪高尔基体（图1B）; ER Tracker蓝色荧光示踪内质网（图1D）; B、 C和D图象经计算机叠加后, 发现绿色荧光与红色荧光和蓝色荧光互相不重叠（图1A）, 说明融合蛋白EGFPCLL1不在高尔基体和内质网表达, 可能仅存在于细胞质基质中。
图1 EGFPCLL1融合蛋白在CHO细胞内的定位（略）
A: B、 C和D计算机叠加后结果; B: BODIPY TR染色的高尔基体（红色信号）; C: 表达的EGFPCLL1融合蛋白（绿色信号）; D: ER Tracker BlueWhite DPX染色的内质网（蓝色信号）.
2.2 Western blot鉴定 pEGFPC1空质粒转染CHO细胞, 在胞质部分和细胞核、 高尔基体、 内质网部分中均发现相对分子质量（Mr）大约30000的EGFP蛋白; pEGFPCLL1转染CHO细胞, 在胞质中发现Mr约60000的EGFPCLL1融合蛋白, 细胞核、 高尔基体、 内质网部分中没有发现相同蛋白（图2）。用EGFP单克隆抗体(mAb)进行免疫沉淀, 浓缩上清液中相应抗原, pEGFPC1空质粒转染CHO细胞的细胞裂解物, 发现Mr大约30000的EGFP蛋白, pEGFPCLL1转染CHO细胞的细胞裂解物, 发现Mr大约60000的EGFP融合蛋白, CHO细胞、 pEGFPC1空质粒转染细胞和pEGFPCLL1转染细胞的培养上清中均没有发现EGFP蛋白（图3）。
图2 转染细胞不同部位融合蛋白Western blot分析（略）
M: 蛋白marker; 1: 空白载体转染CHO细胞质部分; 2: 融合载体转染CHO细胞质部分; 3: 空白载体转染CHO细胞的细胞核、 高尔基体、 内质网部分; 4: 融合载体转染CHO细胞的细胞核、 高尔基体、 内质网部分.
图3 细胞培养上清液中融合蛋白Western blot分析（略）
M: 蛋白marker; 1: 空白载体转染CHO细胞裂解物; 2: 融合载体转染CHO细胞裂解物; 3: CHO细胞培养上清液; 4: 空白载体转染CHO细胞培养上清液; 5: 融合载体转染CHO细胞培养上清液.
3 讨论
GFP是一种独特的报告蛋白, GFP基本不影响宿主细胞, 因而可以鉴定、 跟踪、 分选表达的活细胞。由于细胞本身没有GFP基因, 将GFP和另一基因的编码区相连得到的融合体, 可以研究目的蛋白的定位。将研究的基因克隆进增强型重组GFP质粒pEGFPC1中, GFP和基因的编码区被整合在CMV启动子下游, 可在真核细胞中表达融合蛋白并在蓝色激光下产生绿色荧光, 从而可得知所研究的基因表达蛋白的细胞内定位信息。
本研究中, 我们使用已构建含CLL1全cDNA表达序列的绿色荧光真核表达载体pEGFPCLL1, 转染CHO细胞,使用内质网和高尔基体示踪荧光染料染色, 荧光显微镜下观察和采集图像。发现融合蛋白的绿色荧光与内质网、 高尔基体不重叠, 说明融合蛋白存在于细胞质基质中, 而不存在于内质网和高尔基体内。用Western blot检测发现在pEGFPC1空质粒转染CHO细胞, 在细胞质和细胞核、 高尔基体、 内质网部分中均发现Mr大约30000的EGFP蛋白; 而pEGFPCLL1转染CHO细胞, 在细胞培养上清液和细胞核、 高尔基体、 内质网部分中均没有发现Mr大约60000的CLL1融合蛋白; 进一步印证CLL1蛋白主要表达于真核细胞的细胞质中, 不表达在内质网、 高尔基体和细胞核中, 也不分泌到细胞外。其他胶原样凝集素（如MBL、 SPA、 SPD等）主要为分泌型蛋白, 发挥重要的固有免疫作用[4, 6]。而CLL1是已发现的惟一存在于胞质中的胶原样凝集素蛋白, 推测其具有独特的生物学作用, 对它在人体组织内的分布和功能需要进一步深入研究。
【参考文献】
[1] Ohtani K, Suzuki Y, Eda S, et al. Molecular and cloning of a novel human collectin from liver (CLL1)[J]. J Biol Chem, 1999, 274(19): 13681-13689.
[2] Nakagawa T, Ma BY, Uemura K, et al. Role of mannanbinding protein, MBP, in innate immunity[J]. Anticancer Res, 2003, 23(6): 4467-4471.
[3] Sano H, Kuroki Y. The lung collectins, SPA and SPD, modulate pulmonary innate immunity[J]. Mol Immunol, 2005, 42(3): 279-287.
[4] Boussif O, Lezoualc HF, Zanta MA, et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: Polyethylenimine[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92(16): 7297-7301.
[5] De Duve C, Pressman BC, Gianetto R, et al. Tissue fraction studies. 6. Intracellular distribution patterns of enzymes in ratliver tissue[J]. Biochem J, 1955, 60(4): 604-617.
[6] Keshi H, Sakamoto T, Kawai T, et al. Identification and characterization of a novel human collectin CLK1[J]. Microbiol Immunol, 2006, 50(12): 1001-1013.
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