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细胞周期负反馈调控通路的研究进展
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【西医学论文网】作者:袁晓华 张焕铃 刘福英【关键词】 ARF;INK4a;RB ;E2F1 1 P16INK4ACDKsRB和P19ARFMDM2P53的相互制约关系 鼠双微体(MDM2)基因,最初由Donna Geroge及其合作者在自发肿瘤鼠Balb/c3T3成纤维细胞系中鉴定出来。 MDM2具有在细胞核和细胞质之间穿梭的功能,人类的MDM2定位于染色体12q1314,MDM2的(1)区内具有核定位(NLS)与核输出(NES)序列,利用其NLS序列与细胞核内的P53相结合,然后利用其NES信号,将P53运到胞浆,再通过其自身的E3泛素连接酶活性,使P53蛋白泛素化而降解。然而P53的活化又能促进MDM2的转录,这样就在P53与MDM2之间形成一个负反馈环,这对于维持MDM2与P53之间的平衡非常重要。最近研究发现的一种小分子物质Nutline,是顺式咪唑啉的衍生物,可以抑制MDM2的功能。Nutline可以通过细胞膜进入细胞内,从MDM2的P53结合域的疏水口袋里将P53替换出来〔1〕。 人类基因P16(INK4A)位于染色体9p21,由于mRNA的不同剪切,其编码的基因产物有两种,即P16INK4A和P19ARF,外显子1β通过剪切与外显子2 、3相连形成了P19ARF的mRNA,而P16INK4A选择了外显子1α和外显子2 、3,做为其mRNA的拼接方式,两种产物共享外显子2和3,外显子1α和1β分别由各自独立的启动子启动。P19ARF能通过与MDM2相结合,加速MDM2的降解,从而稳定P53蛋白,使P53积累。而P16INK4A同周期蛋白D竞争性的与细胞周期素依赖性激酶(CDK)结合,抑制cyclinDCDK4/6的活性。 正常情况下,视网膜母细胞瘤蛋白(RB)存在于整个细胞周期中,它能与许多转录调控因子结合,它的结合能力受自身磷酸化状态的限制,只有非磷酸化的RB才具有抑制细胞增殖的活性,具有G1→S、G2→M期的细胞阻滞活性。非磷酸化的RB和E2F结合,抑制细胞的转录。而cyclinDCDK可使RB磷酸化导致RBE2F解离,释放E2F,E2F参与基因的转录,协助细胞通过G1期。P16INK4A同周期蛋白D竞争性的与CDK结合,抑制cyclinDCDK4/6的活性,从而抑制RB的磷酸化,使RBE2F复合物发挥其抑制转录的活性。 P21cip1与P27kip1都是周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制蛋白,可以与cyclinCDK复合物结合。cyclinD在G1期早期表达,跨越整个G1期;而cyclineE在G1期末表达,在G1/S交界处急剧升高达高峰。P21cip1与P27kip1和cyclinDCDK4/6结合则稳定并激活cyclinDCDK4/6〔2〕,P21cip1与P27kip1与cyclineECDK2结合则会抑制cyclineECDK2的活性,cyclineECDK2是G1/S相转换调控的汇合点,如果P21cip1和P27kip1被cyclinDCDK4/6捕获,使得cyclineECDK2的活性得到释放,cyclineECDK2进一步磷酸化RB,释放E2F,细胞进入S期。P16INK4A可以通过破坏cyclineDCDK的复合物,释放P21CIP1和P27KIP1,抑制cyclineECDK2,进而抑制了RB的磷酸化。所以说P16INK4A是间接抑制cyclineECDK2的活性〔2,3〕。如果没有P21cip1或P27kip1就不能体现出P16INK4A的活性。P21cip1和P27kip1基因敲除鼠的成纤维细胞cyclineD1CDK4复合物的水平下降,人为的提高CDK2的活性,仍然不能对P16INK4A所诱导的细胞周期阻滞产生应答〔2,3〕。所以说RBE2F将P16INK4ACDKsRB和P19ARFMDM2P53这两条通路联系在一起〔2,4〕。P53所诱导的蛋白P21CIP1能够抑制cyclinECDK2的活性,使RB保持非磷酸化状态,与转录延长因子E2F相结合,发挥其细胞周期阻滞的作用。如果P53的活性降低,不能有效诱导P21CIP和P27CIP的表达,恢复E2F的活性,那么细胞周期就会绕过P16INK4A诱导的细胞周期阻滞这条通路〔4〕,RB失去活性释放E2F,可以诱导P53的表达,但是保持RB与E2F的结合,来抑制E2F的活性,是P19ARF和P53所介导的细胞周期阻滞所必需的。如果细胞RB基因家族全部缺失,将会对P19ARF的诱导凋亡作用产生抵抗〔5,6〕。 P16INK4ACDKsRB和P19ARFMDM2P53这两条履行细胞增殖调控的通路是相辅相成缺一不可的,任何一条通路的阻滞,都能让细胞的周期出现紊乱。 2 E2F诱导凋亡的通路 最近研究发现,E2F1的过表达可以诱导凋亡,E2F/的小鼠,表现胸腺细胞过多,这可能与未成熟前生长素应答因子(ARF)和P53的功能不能得到有效诱导有关。然而这种现象同样发生在已经衰老的E2F/小鼠,说明E2F1可以促进肿瘤细胞的凋亡〔7~9〕。前面提到Nutlin可以抑制MDM2的功能,在那些没有发生P53突变的癌细胞中,可以利用Nutline来解除MDM2对P53的抑制作用,恢复P53的转录激活作用。然而研究发现在P53缺失的结肠癌细胞(HCT116)中,这种小分子物质仍然能在某种程度上诱导凋亡。这种凋亡是依赖于E2F1所诱导的凋亡〔10〕。事实上MDM2也存在非依赖P53的途径,它可以和许多蛋白相结合,包括P14ARF、pRb、P73、E2F1/DP1等〔10〕。MDM2与E2F1/DP 的结合可以刺激E2F的转录激活作用。Nutline与MDM2的结合可以抑制MDM2与E2F1的结合,使E2F1得到释放,在DNA损伤的情况下来诱导前凋亡基因P73α、NOXA的表达,进而诱导凋亡〔11〕。E2F1可以和ARF的启动子特异性结合,诱导ARF表达,来增强P19ARFMDM2P53通路的细胞周期阻滞的功能。E2F1可以诱导P53凋亡刺激蛋白(ASPPS)的表达,ASPPS是P53的辅助因子可以增强P53的转录激活作用〔12,13〕。E2F1可以协同P53来诱导前凋亡基因的表达如:PERP 、SIVA、APAF、具有(BH3)同源结构域蛋白、PUMA、NOXA 。E2F1 还可以诱导P73的表达,以一种非依赖P53的机制来诱导凋亡。 DNA受损伤后,E2F的表达量增高,可以激活ATM/ATR,chk1和chk2使E2F1的N末端结构域磷酸化,这样避免了E2F1被泛素化而降解,然而这种磷酸化同样发生在C末端的364位丝氨酸位点,这两种磷酸化综合起来,对E2F1稳定性的影响还不能确定。但能确定的是E2F1的诱导凋亡的作用增强了,ATM/ATR可以进一步磷酸化P53,稳定P53四聚体的结构,促进P53发挥诱导凋亡的作用〔14〕。 在DNA 受损伤以后,E2F被乙酰化,乙酰化可以稳定E2F1,同时刺激它的转录激活作用,有趣的是,P/CAF导致的E2F1的乙酰化可以增加E2F1对靶基因的选择性。尤其是其对前凋亡基因的选择如P73、APAF1。E2F1的过表达促进P53的磷酸化和稳定,这种效应不依赖ARF〔15〕。 可能E2F过表达本身就促进DNA损伤,通过诱导无节制的DNA复制来实现DNA的损伤,这与Hemann提出的假说〔16〕看法一致,也就是癌基因所诱导的增殖可以导致DNA损伤和细胞老化两种结果。 Hallstorm与Nevins鉴定出Jab1蛋白可以和E2F1相互作用来增强其诱导凋亡的作用,而Jab1并不增加E2F1所介导的促进细胞增殖的作用〔17〕。研究发现抗凋亡蛋白Api5,它可以抑制E2F1所介导的凋亡,但它不影响E2F1所介导的转录,目前其作用机制还不清楚〔18〕。 3 ARF的非依赖P53的调控通路 ARF也有不依赖P53抗细胞增殖功能。MDM2、ARF、P53三种基因都缺失的小鼠比单独缺失ARF 或P53的小鼠发生的肿瘤种类和数目要多。这种三种基因都缺失的小鼠肿瘤发生的速度快,而且肿瘤遍布全身不同的组织和脏器。这些组织包括间质细胞、表皮细胞、造血细胞、神经细胞。因此,ARFMDM2P53通路并不是严格的线性关系〔4〕。 在P53功能缺失的鼠胚胎成纤维细胞中,ARF仍然能够抑制鼠胚胎成纤维细胞的增殖。自由状态的E2F1增多可以诱导ARF的表达,ARF反过来可以和E2F1相结合,来抑制E2F1的转录激活作用。ARF还可以和E2F1的功能伴侣DP1相互作用,促进后者进入核仁而被蛋白酶体水解,但ARF对E2F1/DP1复合体不起作用〔19〕。ARF通过阻止早期核糖体的成熟来发挥其细胞周期阻滞的作用。NPM/B23在核仁中含量较高,它可以通过RNAase来指导rRNA前体的分裂,ARF 通过N 端的214个氨基酸和NPM/B23的B23的寡聚区相结合,来影响rRNA的加工〔20〕。ARF促进小分子的泛素修饰物(SUMO)与解旋酶WEN结合,这种结合方式类似于MDM2与P53的结合,使WEN在细胞核内重新分布,在某种程度上制约S期的复制。ARF还可以和Cmyc的亮氨酸拉链和转录调控结构域相结合阻止其转录激活,对抗Cmyc诱导细胞分化增殖的功能,但ARF并不影响Cmyc的诱导凋亡的功能〔21〕。在P53/P21通路缺失的细胞中ARF可以诱导G2/M期阻滞,ARF通过抑制P34cdc2激酶,同时下调cdc25,使P34cdc2的酪氨酸磷酸化,从而使细胞阻滞在G2期〔22〕。 4 结 语 P16INK4ACDKsRB和P19ARFMDM2P53是两条经典的细胞周期调控通路,它们通过RBE2F1汇合于一点,在细胞周期调控中发挥着相辅相成的作用。在许多癌细胞中都发现了这两条通路的功能发生异常,RB的缺失突变、CDK4的过表达或突变、P16INK4A的点突变、P53的突变或缺失、MDM2过表达、P14ARF缺失都能导致这两条通路发生功能异常。然而这两条通路并不能完全解释细胞周期调控的现象。最近研究发现的E2F1除了促进细胞增殖还可作为一种肿瘤抑制因子,诱导细胞凋亡〔7~9〕;ARF的非依赖P53细胞周期调控作用都是对这两条通路的有效补充。两条经典通路中是否还涉及其他未知的分子?E2F1是如何行使促进细胞增殖和促进细胞凋亡的两种截然不同的功能?除了前面提到的分子,ARF还和哪些分子相互作用来发挥其不依赖P53的细胞周期调控功能?这些问题都有待于进一步研究。 【参考文献】 1 Mills AA,Zheng B,Wang XJ,et al.P63 is a p53 homologue required for limb and epidermal morphogenesis〔J〕.Nature,1999;398(6729):70813. 2 Cheng M,Oliver P,Diehl JA,et al.The p21(Cip1) and p27(Kip)1 CDK‘inhibitors’are essential activators of cyclin Ddependent kinases in murine fibroblasts〔J〕.EMBO 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