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聚乙二醇-聚乙烯亚胺共聚物介导体外基因传递
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【药学自我鉴定范文】【摘要】 【目的】 研究非病毒基因载体聚乙二醇(PEG)-聚乙烯亚胺(PEI)共聚物的组成对体外介导基因传递的影响。【方法】 将含PEG不同分子量和接枝量的PEG-PEI共聚物，与DNA形成复合物。考察带正电荷的PEI与带负电荷的DNA的相互作用，测定了PEG-PEI/DNA复合物的粒径和Zeta电位，及对Hela细胞的毒性和转染率。【结果】 PEG侧链并未明显影响PEI与DNA形成复合物的能力；连接PEG 5 000 能够明显降低复合物的粒径；复合物的Zeta电位随着PEG接枝量的增加而降低；细胞毒性不依赖于PEG的分子量的变化，而是取决于PEG的接枝量；共聚物PEG-PEI(2-25-1)被证实为较有效的介导体外基因传递的复合物。【结论】 共聚物的结构组成对DNA复合物的理化性质、毒性和转染率都产生较大的影响。
【关键词】 PEG-PEI共聚物； 非病毒基因载体； 基因转染
基因治疗是将外源性基因导入靶细胞内有效表达，从而使得在基因水平治疗一些顽疾成为可能。将外源性基因导入体内必须借助于一个安全、稳定、转染率高的载体。目前，基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体。体内基因治疗80%采用病毒载体系统作为基因传输载体, 例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等,非病毒载体包括脂质体和阳离子聚合物。病毒载体与非病毒载体相比转染率高，但存在着一些安全隐患，如对特异的细胞有限制性靶向性，DNA装载量有限，潜在的病毒重组和成本较高等问题使得它的实际应用受到限制[1]。非病毒载体如阳离子脂质体和阳离子共聚物可克服目前病毒载体在安全性、免疫原性和价格方面等问题[2]。在目前应用的非病毒载体中，多聚阳离子共聚物聚乙烯亚胺（polyethylenimine, PEI），在体内外都表现出高的转染率[3]。 PEI的重复结构单体中每两个碳原子就连接含氮原子的伯胺和仲胺，支链型的PEI还包括叔胺，都可质子化生成正电性氨基，成为与DNA上带负电荷的磷酸根结合的作用点，形成纳米级的聚合物/DNA复合物，可被细胞摄取。另一方面，大量的阳离子电荷产生较大的毒性，限制了阳离子共聚物的体内应用。因此，许多学者研究将阳离子共聚物连接上非离子的亲水性基团，如聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）[4]， 聚[N-（2-羟丙基）异丁烯酰胺] [5]。这些亲水性的共聚物可提高复合物的溶解性，减少聚集，减少生理环境下与蛋白的非特异性相互作用 [6]。本文采用异佛尔酮二异氰酸酯（isoporon diisocyanate, IPDI）作为偶联剂制备了含不同PEG分子量和接枝量的PEG-PEI共聚物。考察了聚合物/DNA复合物的粒径和zeta电位，还考察了转染率与PEG-PEI共聚物的毒性和结构的关系。研究PEG链长与接枝量对基因传递过程的影响和规律。
1 材料和方法
1.1 试剂
聚乙烯亚胺（PEI，MW25000， Aldrich-Sigma公司产品，支链型，无水）；聚乙二醇单甲醚(mPEG, MW 为2000和5000 ，Fluka公司)； IPDI(广州市汇采涂料化学品有限公司，进口分装）；二月桂酸二丁基锡（dibutyltin dilaurate, DBTL，广东丽宝涂料助剂公司）。
1.2 细胞系
人宫颈癌细胞系 Hela细胞（ATCC No.CCL-2.1），在100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养基中培养。血清56 ℃灭活30 min。
1.3 质粒
真核表达质粒编码增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, pEGFP-C1)，由华西医科大学惠赠，由CMV启动子驱动，在DH5α菌株中大量扩增。由QIAGEN公司的质粒大抽提试剂及纯化柱制备质粒，酶切鉴定。
1.4 异氰酸酯单端基聚乙二醇（PEG-NCO）的制备
定量的mPEG溶于无水氯仿中，加入过量的IPDI，溶于氯仿，再加入0.6%～0.7%的催化剂DBTL。将上述两溶液混合， 75 ℃左右回流反应8 h，所得产物在石油醚中沉淀，沉淀用氯仿溶解，再用石油醚沉淀，此操作重复多次直至将过量的IPDI去除干净，真空干燥，得白色蜡状至粉末状固体。
1.5 PEG-PEI嵌段共聚物的合成
将PEI用一定量的氯仿溶解，磁力搅拌下将PEG-NCO的氯仿溶液逐滴加入PEI溶液中，再加入0.6%～0.7%的催化剂DBTL，置60 ℃回流反应16 h，将亮黄色溶液浓缩至约50 mL左右，再用大量乙醚沉淀，过滤，真空干燥，称质量。
1.6 PEG-PEI/DNA复合物的制备
根据不同的N/P比，即聚合物中的氨基基团与DNA中的磷酸基团的摩尔比，用PBS制备一定的聚合物溶液，与质粒DNA的PBS溶液混合，涡旋，室温静置30 min,以获得聚合物/DNA复合物。
1.7 细胞毒性测定（MTT法）
PEI、PEG-PEI共聚物在100 mL/L胎牛血清的1640培养基中配成不同浓度梯度，分别为1、3、5、10、15、20 μg/mL。将Hela细胞接种到96孔板上，密度为5 000个细胞/孔，细胞培养24 h。吸去每孔中的旧培养液，加入不同浓度的含PEI及PEG-PEI共聚物的培养液，每孔0.2 mL，每个浓度4个复孔，37 ℃，5% CO2 培养箱中培养24 h后更换正常的 RPMI 1640培养液继续培养48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，继续培养4 h，吸尽培养液，每孔加入DMSO溶液150 μL ，在Bio-Tek Elx800型酶标仪490/630 nm波长处读取吸光度值（A），计算细胞活力（%）=实验组A490/630/阴性对照组A490/630×100%。
1.8 琼脂糖凝胶电泳阻滞试验
为了证明正电荷的PEI与负电荷的质粒DNA之间的相互作用，采用琼脂糖凝胶电泳阻滞试验。将DNA与不同浓度的PEI、PEG-PEI共聚物按N/P比分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5，在PBS中形成复合物，室温静置30 min。电泳条件：10 g/L琼脂糖（含0.5 μg/L溴化乙锭），1 × TBE缓冲液，电压80 V，电泳时间40 min。DNA条带在紫外灯下进行观察。
1.9 粒径和Zeta电位测定
将DNA与不同浓度的PEI和PEG-PEI共聚物分别按一定的N/P比在PBS中形成复合物，使DNA的终浓度为20 μg/mL，室温静置30 min，在Zetasizer Nano Series 90 粒径分析仪上，测定粒径及Zeta电位。
1.10 细胞转染试验
将Hela细胞接种到12孔板上，密度为15 000个细胞/孔，培养24 h，细胞汇合度≥70%，将PEI、PEG-PEI共聚物与DNA分别在PBS中配成一定浓度的溶液，然后将两者以一定的N/P比混合，涡旋，室温静置30 min。转染前吸去细胞培养液，加入不含血清的RPMI1640培养液1 mL，再每孔加入100～200 μＬ的PEG-PEI/DNA复合物，细胞培养箱中培养4 h后，吸去转染复合物，加入新鲜的含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养40～48 h，转染后用PBS冲洗，再用0.25 g/L胰酶/EDTA消化液将细胞消化下来，用PBS重悬细胞，转染率通过在流式细胞仪上测定每10 000个细胞中发荧光的细胞百分数获得。
2 结 果
2.1 共聚物的合成
共聚物的合成方法参照文献[7]，PEG-PEI共聚物中两组分的比例见表1。
2.2 细胞毒性试验
RGR (relative growth rate)为相对增值百分率，通过细胞的存活率来推定聚合物载体内在的细胞毒性。其值越大则毒性越小。从图1显示结果可以看出，均聚物PEI的细胞毒性随着浓度的增高显著增加，而共聚物在低浓度10 μg/mL以下时未表现出明显毒性，15 μg/mL以上时PEG-PEI的毒性比PEI明显减少，且随着共聚物中聚乙二醇含量的增加而降低。接枝PEG的分子量不同，对共聚物的毒性未见明显影响。
2.3 琼脂糖凝胶电泳阻滞试验
图2表明，PEI均聚物在N/P =2时可完全和DNA结合，阻止溴乙锭插入DNA双螺旋结构中，故观察不到荧光，当每个PEI上连接10.5个PEG 2 000即PEG-PEI(2-25-3)和每个PEI上连接7.2个PEG5 000即PEG-PEI(5-25-3)时，DNA在N/P为2.5的时候可被完全阻滞，说明接枝PEG后，对PEI结合DNA的能力没有显著影响。
2.4 粒径和Zeta电位
许多学者研究发现,DNA/载体复合物粒径是影响转染效率的主要因素之一[8]，随着N/P比增加，复合物的粒径均逐渐减少，同时PEG 5 000能显著影响PEG-PEI/DNA复合物的粒径，且随着PEG 5 000比例的增加，粒径呈减少趋势。接枝不同分子量的PEG对粒径也有不同影响。当接枝分子量较小的PEG 2 000时，粒径相对较大（图3）。
PEG-PEI的Zeta电位比PEI均聚物低，而且随着PEG含量的增加而降低。在N/P=10时，PEI的Zeta电位约为40 mV；当接枝的分子量为2 000的PEG时，随着PEG含量的增加，Zeta电位逐渐降低，最小到达28 mV；当接枝分子量为5 000的PEG时，随着PEG含量的增加，Zeta电位下降更快，最终降低到20 mV（图4）。
2.5 转染试验
复合物的转染试验用与毒性试验相同的HeLa细胞研究。GFP转染进入细胞40～48 h观察荧光表达（图5）。从转染试验结果可以看出，PEI接枝少量的PEG 2 000或PEG 5 000可使转染率提高，PEG-PEI(5-25-1)在N/P为20、30、50时的转染率均较PEI有所提高，而PEG-PEI(2-25-1)的转染率提高显著，且在N/P比为30的时候达到最大值。随着PEG含量继续增加，PEG-PEI的转染率与PEI相比有降低的趋势。由于PEI的毒性较大，当N/P比增加至50时，细胞死亡较多，转染率都较共聚物低（图6）。
3 讨 论
共聚物的合成是将线性的PEG接枝到支链的PEI大分子上，本反应需要一个既与PEG上的羟基反应，又与PEI上的氨基反应的偶联剂，异佛尔酮二异氰酸酯（IPDI）符合此要求。IPDI属脂环族二异氰酸酯，IPDI的2 个异氰酸基连接方式不同，活性也不同，脂链上NCO的活性比脂环上的NCO的活性大8～10倍。在预聚反应中mPEG被活化，脂链上的NCO在催化剂作用下先与PEG上的-OH反应，脂环上的NCO再与PEI上的氨基反应，故反应简单，副反应少。
文献报道，分子量较大的PEI毒性也较大[9],经无毒、抗免疫原性的水溶性大分子PEG修饰PEI后，与DNA自组装成核壳结构胶束，其芯核由PEI与DNA通过静电作用缔合而成，PEG构成保护性的水溶性外壳，从而使PEI的毒性降低。接枝PEG的量越多， PEI的毒性降低的越多。接枝分子量小的PEG毒性降低是由于相对接枝PEG的条数增多所致。
琼脂糖凝胶电泳阻滞试验中，溴乙锭插入DNA中可产生强烈的荧光，而当它在溶液中游离时荧光几乎观察不到，PEI上的带正电荷的氨基基团与DNA上带负电荷的磷酸基团通过电性的相互吸引结合成复合物，通过此试验可证明带正电荷的PEI及PEG-PEI共聚物与带负电荷的DNA之间的结合情况。PEI与PEG形成共聚物后并未明显影响其结合DNA的能力。同时在形成复合物的过程中,将DNA高度压缩,可掩蔽DNA使其不易被酶降解[10], 从而起到对DNA的保护作用。
粒径和Zeta电位也受PEG的分子量及接枝量的影响，Petersen等[11]报道降低PEG相对分子质量，PEG-PEI/ DNA复合物会逐渐失去其高度压缩的球形结构，变成松散弥漫的不定形状态，使粒径增大。而当接枝分子量较大的PEG时，就可形成清晰的球形复合物。复合物的Zeta电位与细胞的摄取密切相关[12]，分子量较大的PEG链产生较大的屏蔽效应故使表面电荷下降较大[13]。
从以上测定结果可以分析各因素与基因转染试验的联系。接枝PEG后对DNA的浓缩能力和对DNA的保护作用没有较大影响，故此两因素在本试验中对转染不会产生较大影响。接枝PEG后复合物的粒径在高N/P情况下都有所减少，PEG的分子量不同减少的程度不同。根据文献复合物的粒径与转染率的关系尚有争议，Ogris等[8]报道，粒径较小的复合物(40 nm)在低盐环境下与同样条件下的大粒子( > 1 000 nm)相比转染率较低。还有报道[14]，许多哺乳动物细胞可内吞的粒子直径要小于150 nm范围。故粒径大小对转染也并非决定性因素。细胞毒性对转染影响较大，当毒性较大时，转染率很低。接枝PEG可降低的PEI的毒性，增加水溶性，然而接枝较多的PEG会产生屏蔽效应，阻止DNA复合物与细胞膜的接触，从而使转染率下降；高的Zeta电位对于体外转染是有益的，因为高的Zeta电位可增加阳离子复合物与带负电荷的细胞膜的粘附，然而过大的Zeta电位又会产生较大的毒性，降低转染率。因此在本研究中与PEG-PEI/DNA复合物转染试验的结果关系最为密切的因素为细胞毒性和Zeta电位，要降低毒性而保持较高的Zeta电位，PEG的接枝量是个关键。本研究结果显示，PEG-PEI(5-25-1)和PEG-PEI(2-25-1)的转染率均较PEI有所提高，尤其以PEG-PEI(2-25-1)在N/P=30时的转染率为最高。毒性在高浓度20 μg/mL 时RGR值分别为35%和38%均比PEI的25%高，说明降低了毒性，而PEG-PEI(2-25-1)使毒性降低更多。Zeta电位随着PEG量的增加而逐渐降低，分子量较大的PEG链产生较大的屏蔽效应使表面电荷下降较大，因此PEG-PEI(2-25-1) 的Zeta电位较PEG-PEI(5-25-1)的Zeta电位大。故毒性较低， Zeta电位较高的PEG-PEI(2-25-1)表现出较大的转染效率。该嵌段共聚物有望成为新型非病毒基因载体材料。
【参考文献】
CRYSTAL R G. Transfer of genes to humans: early lessons and obstacles to success [J]. Science, 1995, 270(5235):404-410.
HAN S, MAHATO R I, SUNG Y K, et al. Development of biomaterials for gene therapy [J]. Mol Ther, 2000, 2(4):302-317.
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