| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略词(Abbreviation) | 第11-13页 |
| 1 文献综述 | 第13-23页 |
| 1.1 乙型脑炎的流行病学及历史 | 第13-14页 |
| 1.2 JEV的病原学特性 | 第14-15页 |
| 1.2.1 JEV理化特性 | 第14页 |
| 1.2.2 JE的生物学特性 | 第14页 |
| 1.2.3 JE的增殖特性 | 第14-15页 |
| 1.2.4 JEV的致病机制 | 第15页 |
| 1.3 JEV分子生物学特性 | 第15-16页 |
| 1.3.1 JEV的基因组结构 | 第15-16页 |
| 1.3.2 JEV的主要结构蛋白-E蛋白 | 第16页 |
| 1.4 JEV感染的主要临床症状和病理变化 | 第16-17页 |
| 1.4.1 JEV感染的临床症状及致病性 | 第16-17页 |
| 1.4.2 JEV感染的病理变化 | 第17页 |
| 1.5 JE的诊断及防治 | 第17页 |
| 1.6 整合素的研究进展 | 第17-23页 |
| 1.6.1 整合素的基因结构 | 第17-19页 |
| 1.6.2 整合素的配体及分类 | 第19-20页 |
| 1.6.3 整合素的活化机制-构象改变 | 第20-21页 |
| 1.6.4 整合素的作用 | 第21页 |
| 1.6.5 整合素αvβ3的简介 | 第21-23页 |
| 2 研究目的和意义 | 第23-24页 |
| 3 材料与方法 | 第24-37页 |
| 3.1 实验材料 | 第24-26页 |
| 3.1.1 毒株、细胞与菌株 | 第24页 |
| 3.1.2 载体与质粒 | 第24页 |
| 3.1.3 工具酶和主要试剂 | 第24-25页 |
| 3.1.4 主要培养基及其配制 | 第25页 |
| 3.1.5 相关缓冲液与试剂及其配制 | 第25-26页 |
| 3.1.6 本研究所使用的引物 | 第26页 |
| 3.2 实验方法 | 第26-37页 |
| 3.2.1 质粒构建 | 第26-30页 |
| 3.2.1.1 感受态细胞制备(以大肠杆菌DH5α为例) | 第26-27页 |
| 3.2.1.2 限制性内切酶酶切反应 | 第27页 |
| 3.2.1.3 PCR扩增反应 | 第27页 |
| 3.2.1.4 PCR产物扩增,扩增产物及酶切产物的电泳检测 | 第27页 |
| 3.2.1.5 PCR或酶切产物的回收纯化 | 第27页 |
| 3.2.1.6 目的片段与载体连接反应 | 第27-28页 |
| 3.2.1.7 连接产物的转化 | 第28页 |
| 3.2.1.8 重组质粒的小量制备(OMEGA小提试剂盒) | 第28页 |
| 3.2.1.9 重组质粒的大量制备(OMEGA去内毒素大提试剂盒) | 第28-30页 |
| 3.2.2 定点突变技术改造质粒 | 第30页 |
| 3.2.3 细胞的传代 | 第30页 |
| 3.2.4 细胞转染 | 第30-31页 |
| 3.2.5 空斑实验检测 | 第31-32页 |
| 3.2.5.1 空斑前样品处理 | 第31页 |
| 3.2.5.2 空斑实验方法 | 第31-32页 |
| 3.2.6 间接免疫荧光检测 | 第32页 |
| 3.2.6.1 间接免疫荧光试验前样品处理 | 第32页 |
| 3.2.6.2 间接免疫荧光试验方法 | 第32页 |
| 3.2.7 Western blotting检测 | 第32-33页 |
| 3.2.7.1 检测样品的准备 | 第32页 |
| 3.2.7.2 SDS-PAGE电泳 | 第32-33页 |
| 3.2.7.3 Western blotting检测 | 第33页 |
| 3.2.8 JEV增殖及毒价测定 | 第33-34页 |
| 3.2.8.1 JEV增殖及病毒分离 | 第33页 |
| 3.2.8.2 JEV毒价的测定 | 第33-34页 |
| 3.2.8.3 病毒神经毒力,神经侵袭力的测定 | 第34页 |
| 3.2.9 实时荧光定量PCR检测 | 第34-36页 |
| 3.2.9.1 binding样品处理 | 第34页 |
| 3.2.9.2 RNA的提取 | 第34-35页 |
| 3.2.9.3 RNA纯度与浓度测定 | 第35页 |
| 3.2.9.4 RNA的反转录过程 | 第35页 |
| 3.2.9.5 Quantitative RT-PCR检测 | 第35-36页 |
| 3.2.10 免疫共沉淀实验 | 第36-37页 |
| 4 结果与分析 | 第37-50页 |
| 4.1 JEV感染性克隆的构建 | 第37-42页 |
| 4.1.1 全长质粒的构建及病毒粒子的获得 | 第37-38页 |
| 4.1.2 全长病毒粒子的鉴定 | 第38-42页 |
| 4.1.2.1 RT-PCR鉴定 | 第38-39页 |
| 4.1.2.2 Western blotting鉴定 | 第39页 |
| 4.1.2.3 间接免疫荧光鉴定 | 第39-40页 |
| 4.1.2.4 病毒空斑滴度及毒力的测定 | 第40-41页 |
| 4.1.2.5 病毒一步法生长曲线的绘制 | 第41页 |
| 4.1.2.6 两种病毒遗传稳定性的Western blotting检测 | 第41-42页 |
| 4.2 整合素αv/β3在JEV复制中功能研究 | 第42-50页 |
| 4.2.1 αv和β3对JEV复制的影响 | 第42-45页 |
| 4.2.1.1 αv和β3下调表达对JEV复制影响 | 第42-43页 |
| 4.2.1.2 宿主细胞αv和β3蛋白封闭后对JEV复制影响 | 第43-44页 |
| 4.2.1.3 CHO细胞上过表达β3对JEV增殖的影响 | 第44-45页 |
| 4.2.1.3.1 JEV在CHO细胞上的增殖 | 第44-45页 |
| 4.2.1.3.2 CHO细胞过表达β3后JEV感染情况的鉴定 | 第45页 |
| 4.2.2 αv/β3影响JEV复制的机制初步研究 | 第45-50页 |
| 4.2.2.1 αv/β3影响JEV增殖过程中的吸附阶段 | 第45-46页 |
| 4.2.2.2 RGD多肽对JEV复制的影响 | 第46-47页 |
| 4.2.2.3 EDTA对JEV复制的影响 | 第47-48页 |
| 4.2.2.4 αv/β3与JEV E蛋白相互作用 | 第48-50页 |
| 4.2.2.4.1 真核表达质粒的构建 | 第48页 |
| 4.2.2.4.2 蛋白共定位试验 | 第48-49页 |
| 4.2.2.4.3 Co-IP检测蛋白相互作用 | 第49-50页 |
| 5 讨论分析 | 第50-53页 |
| 6 结论 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-58页 |
| 致谢 | 第58页 |
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