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二精丸提取工艺的实验研究
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【西药学科研论文】作者：喇孝瑾，白素芬，刘倩，喇万英【摘要】 目的优选二精丸的提取工艺。方法采用水提醇沉法，以浸膏得率和多糖含量为指标，用正交实验法优选工艺条件。结果最佳条件为：药材脱脂后，加10倍量水于80℃水浴中温浸3次，每次2h，离心(3 000 r·min-1)20 min，合并上清液。加入乙醇使含醇量为80%。
结论优选工艺稳定，安全，简便易行。
【关键词】 二精丸； 正交实验； 提取工艺； 水提醇沉
Abstract：ObjectiveTo establish the optimal extraction technology of Erjing Pill. MethodsOrthogonal test design was adopted according to the extractive rate and content of Polysaccharides. ResultsThe optimal extraction process was as follows: 10 fold of water marinated 0.5 h, immersed 3 times and 2 h each time in water bath at 80℃. Precipitating concentration of alcohol was 80%.ConclusionThe optimal technology of Erjing Pill is simple, stable and effective.
Key words： Erjing Pill； Orthogonal test； Extraction technology； Water extraction and alcohol precipitation
二精丸出自《奇效良方卷之二十一·诸虚门》，由黄精，枸杞子组成，又名枸杞丸（《奇效良方卷之三十四·遗精白浊门》），补精气。 “常服助气益精，补填丹田，活血驻颜，长生不老” ［1］。现代研究发现枸杞多糖是枸杞子中的重要活性成分, 具有调节机体免疫力［2］,延缓衰老［3］和降血糖［4］等药理作用。黄精具有增强免疫、降低血脂、血糖和延缓衰老等多种药理作用，其中黄精多糖是黄精重要的有效成分，具有极其重要的生物功能［5］。笔者经研究发现，二精丸多糖具有较好的降血糖作用。本实验采用正交实验法，以二精丸多糖含量为指标成分，对二精丸多糖的提取工艺进行研究，筛选最佳提取工艺。
1 仪器与试药
1.1 仪器722分光光度计、数显恒温水浴锅、电子天平、循环水真空泵、真空干燥箱、离心机、双极旋片式真空泵、高速药物粉碎机。
1.2 试药葡萄糖对照品（中国药品生物制品检定所）；95%乙醇、浓硫酸、苯酚（重蒸）均为 分析纯；水为双蒸水。枸杞、黄精购自唐山医药公司，经我院喇万英教授鉴定分别为宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实，百合科植物黄精Polygomatum sibiricum Red.的干燥根茎。
2 方法与结果
2.1 水提工艺条件的优选
2.1.1 正交实验设计根据二精丸组方功效和生产实际要求，拟定影响浸出效果的3个主要因素A(水浸时间)，B（水浴温度），C（提取次数）为优选因素，每个因素3个水平进行L9(34)正交实验。正交设计见表1。以处方比例称取烘干后粉碎的药材20 g，混匀，脱脂。室温下加95%乙醇100 ml浸泡0.5 h，加热回流1h，过滤，残渣加100 ml 80%乙醇回流1h，过滤。按表1设计的工艺条件，加入10倍量水于水浴中温浸，离心(3 000 r·min-1)20 min，残渣继续加10倍量水于水浴中温浸，离心，合并上清液。表1 正交实验因素水平（略）
2.1.2 浸膏得率测定精密吸取水提液10 ml置于已称重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃真空干燥3 h，置干燥器中，冷却至室温后，迅速精密称重，计算浸膏得率。结果见表2。表2 二精丸多糖正交实验结果（略）
2.1.3 多糖含量测定
对照品溶液的配制：精密称取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品3 mg，置10 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成每毫升中含无水葡萄糖0.3 mg的对照品溶液。
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1 ml，分别置10 ml具塞刻度试管中，各加水至2.0 ml，摇匀，在冰水浴中缓慢滴加0.2% 蒽酮-硫酸溶液至刻度，摇匀，冷却后置沸水浴中保温10 min，取出，立即置冰水浴中冷却10 min，取出，以相应试剂为空白。照紫外-可见分光光度法，在490 nm波长处测定吸光度。 以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，Y= 3.928 7X+ 0.072 3，r=0.999 1。结果表明无水葡萄糖在0.036～0.36 g·L-1范围内，其质量浓度与吸收度线性关系良好。
供试品溶液的制备：取干燥后的二精丸多糖0.01 g，加蒸馏水溶解，定容于250 ml量瓶中，摇匀。即得供试品溶液。
精密度实验：精密吸取对照品溶液6份各0.2 ml，分别置10 ml具塞干燥试管中，照线性关系考察项下方法，自“加水至2.0 ml”起依法操作，测定吸收度。结果RSD为1.08%，表明精密度良好。
稳定性实验：精密移取样品液0.2 ml，按标准曲线项下方法操作，每30 min测一次吸光度,测得平均吸光度为0.168，RSD为2.59%，测定值在120 min内保持稳定。
样品含量测定：精密量取供试液1 ml,按“标准曲线”项下操作,测定吸光度值，并代入回归方程，计算多糖含量。结果见表2。方差分析见表3～4。表3 二精丸多糖浸膏得率方差分析，表4 二精丸多糖含量方差分析（略）。
直观分析表明，以多糖含量为指标，理论最佳工艺为A3B1C3，极差R大小为C＞A＞B。以浸膏得率为指标，较好的方案为为A3B1C3。方差分析表明，以多糖含量及得膏率为指标，提取次数均有显著影响。结合实际角度考虑，拟将提取工艺定为：取枸杞、黄精粉末各半,混匀加5倍量95%乙醇浸泡30 min，加热回流1 h,过滤，残渣加5倍量80%乙醇回流1 h,过滤，残渣加水温浸3次，2h/次，水浴温度80℃，离心，合并上清液，浓缩。
2.2 验证试验称取药材按上述方法进行验证试验，结果浸膏得率为17.07%，多糖含量为36.48%。说明该工艺可行。
2.3 醇沉浓度的优选将上述优选工艺的二精丸提取物等分成3份，分别加入乙醇使含醇量分别达到60%，70%，80%，冷藏过夜,离心,上清液回收乙醇,浓缩,定容于250 ml量瓶中,测定二精丸多糖的含量。测定方法及条件同上。结果表明，二精丸水提部分醇沉至含醇量为80%最佳。此时浸膏得率为11.41%，多糖含量为54.56%。
根据以上研究结果，最佳工艺为：取烘干后粉碎的药材，混匀，室温下加95%乙醇浸泡30 min，加热回流1 h，过滤，残渣加80%乙醇回流1 h,，过滤。滤液弃去。滤渣加入10倍量水于80℃水浴中温浸3次，2h/次，离心(3 000 r·min-1)20 min，合并上清液。加入乙醇使含醇量为80%。
3 讨论
经试验证实，采用苯酚-硫酸法测定二精丸多糖具有准确度高，精密度好，操作简便的特点（试验内容另文发表）。但其不足之处在于仅能测定多糖的总含量,不能对多糖各组分构成情况进行具体分析,还需要进行进一步的研究。
多糖的提取有很多方法，比如：水提醇沉法、水提取法、超声提取法等，前两种为化学方法，第3种是物理方法。由于超声提取法操作比较复杂，提取设备要求较高。故本实验采用的水提醇沉法，用正交设计对制备工艺条件进行了优选，结果显示所制定的制备工艺合理、可行，为保证其稳定的临床疗效提供了基础理论依据。
【参考文献】
［1］可嘉（校注）,明·董宿（辑录）.奇效良方［M］.北京：中国中医药出版社，1995:172，265.
［2］李英杰，齐春会，张永祥.枸杞多糖免疫调节作用机制研究进展［J］.中国新药杂志，2004，13(10):882.
［3］李 晶，欧 芹，孙 洁.枸杞多糖对衰老大鼠蛋白质氧化损伤影响的实验研究［J］.中国老年学杂志，2007，27(24):2384.
［4］王 玲，张才军，李维波，等.枸杞多糖2D 对四氧嘧啶糖尿病小鼠高血糖的防治作用［J］.河北中医，2000，22(2):159.
［5］任汉阳，曹俊岭，张 瑜，等.黄精的临床研究近况［J］.河南中医，2004，24 (1) :79.
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