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大孔树脂对葛根总黄酮的吸附及分离纯化研究
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【药学系毕业论文】【摘要】 以三峡库区丰富的葛根为材料，研究葛根黄酮的分离纯化工艺。方法利用柱层析技术，比较了4种大孔吸附树脂分离纯化葛根总黄酮的效果。结果用AB-8树脂柱进行吸附洗脱，洗脱液为60%乙醇，流速2.4 ml/min，得到的葛根总黄酮（以葛根素计）纯度为53.5%，AB-8树脂的吸附容量为103.2 mg/g。结论建立了AB-8大孔吸附树脂分离纯化葛根总黄酮的适宜条件，发现AB-8大孔吸附树脂在葛根总黄酮的分离纯化中有好的表现。
【关键词】 葛根 黄酮 大孔吸附树脂 分离 纯化
Abstract:Objective Flavonoids were purified from Radix Puerarise of Yichang.MethodsFour excellent macroretiaclar resins were selected for separating flavonoid in Radix Puerarise. ResultsThe extract was absorbed by AB-8 macroporous absorption resin and was eluted with 60% ethanol at 2.4 ml/min eluting speed. The purity of total flavonoids was 53.5%. The absorptive capacity of AB-8 resin was 103.2% mg/g.Conclusion A feasible technnology was AB-8 for sublimating the total flavonoids in Radix puerariae.
Key words:Radix Puerarise; Flavonoid ; Separation ; Purification
大孔吸附树脂（Macro-reticular Resins）是一种不含交换基团的﹑具有大孔结构的高分子吸附剂。主要是以苯乙烯﹑二乙烯苯为原料，在0.5%的明胶水混悬液中，加入一定比例的致孔剂聚合而成。国外大孔吸附树脂商品主要是Amberilite XAD1-11﹑Diaion Hp10-20；我国国内现以自行试制的大孔吸附树脂也有很多，包括如天津南开大学化工厂生产的X-5，H107，S-8，NKA-9，AB-8，D3520，D4006树脂；上海医药工业研究所生产的SIP1300，SIP1400树脂；天津正天成澄清技术有限公司生产的ZTC(黄酮专用)树脂等等。
本文利用葛根70%乙醇回流得到的粗提液为原料，比较了AB-8、NKA-9，D3520，D4006等4种优良大孔吸附树脂分别在不同工艺条件下，分离纯化葛根总黄酮的效果。探讨了AB-8大孔吸附树脂分离纯化葛根总黄酮的工艺方法。
1 器材
1.1 仪器UV-2201紫外分光光度计；自动柱层析分析系统：层析柱(φ15mm×500),HL-2恒流泵，HD-A电脑采集器，HD-3紫外检测仪（上海泸西分析仪器厂）。
1.2 材料
葛根：采自五峰土家族自治县。
葛根素标准品：购于中国药品生物制品检定所；AB-8，NKA-9 ，D3520 ，D4006大孔吸附树脂：购于天津南开大学化工厂；其它化学试剂均为分析纯。
2 方法［1～3］
2.1 葛根粗提液制备采用70%乙醇，对葛根粉以1:10的固液比在85℃先后浸提两次，每次3 h；合并滤液调pH8.5在旋转蒸发器上减压浓缩，以5 000 r/min 在高速离心机上离心30 min过滤，弃沉淀，得到葛根粗提液也即为吸附原液。
2.2 葛根总黄酮含量测定葛根总黄酮含量的测定采用以葛根素为对照品的紫外分光光度法。
2.2.1 标准曲线的绘制精密称取干燥至恒重的葛根素25mg于50 ml容量瓶中，以95%乙醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，含葛根素0.5 mg·ml-1，作为储备液。精密量取储备液0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 ml，以95%乙醇稀至25.00 ml，摇匀。分别于254 nm波长处测定吸光度，制标准曲线图并计算回归方程。
2.2.2 含量测定操作取干燥至恒重的干浸膏粉末（或洗脱液的干燥品）25 mg放入50 ml容量瓶中，加入25 ml 95%乙醇，置磁力加热搅拌器上温热溶解，加乙醇稀释至刻度，摇匀。吸取1.00 ml于25 ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度，摇匀。取1.0 ml乙醇同样稀释作空白对照,在254 nm波长处测定吸光度。换算出葛根总黄酮的含量。
2.3 柱层析分离纯化
2.3.1 大孔吸附树脂预处理95%的乙醇浸泡3～5 d，待其充分溶胀后，用乙醇洗至流出液加适量水无白色浑浊现象，再用去离子水洗尽乙醇。
2.3.2 树脂对葛根黄酮的吸附量与解吸率测定准确称取经预处理的树脂装入带塞磨口三角瓶中，精密加入葛根浸出原液置磁力加热搅拌器上，振荡24 h，待充分吸附后，滤过，测定滤液中剩余黄酮浓度。计算各树脂室温下的吸附量和吸附率。向吸附的饱和树脂中，精密加入95%乙醇，浸泡振荡24 h，滤过，测定滤液黄酮浓度，根据黄酮解吸量计算解吸率。
2.3.3 提取液吸附及洗脱根据待分离的提取液样品中总黄酮含量，选用合适量的处理好的大孔吸附树脂以湿法装柱，连接柱层析系统，加入样品，以去离子水洗脱糖等杂质，同时紫外检测器于280 nm 处检测。当糖等杂质被洗脱后，再以60%乙醇洗脱，洗脱液浓缩，检测总黄酮含量。
3 结果
3.1 含量测定的回归方程建立以“2.2.1”方法绘制标准曲线，并建立浓度对吸光度的线性回归方程：A=67.150 7C +0.062 14；相关系数r=0.995 8，相对标准偏差RSD=0.52%，n=6。
3.2 吸附量的测定以“2.3.2”方法对AB-8，NKA-9，D4006，D4520等4种大孔吸附树脂对葛根黄酮浸提液原液的吸附量做测定。结果见表1。表1 几种大孔吸附树脂吸附性能的比较（略）
用95%乙醇和70%乙醇对充分吸附后的树脂进行解吸率的测定：向吸附饱和的等量树脂中精密加入70%乙醇、95%乙醇各30ml浸泡振摇1d，滤过，测定滤液黄酮浓度，根据吸附量计算解吸率(%)。结果见表2 。表2 在不同解吸剂中4种大孔树脂对葛根黄酮的解吸率（略）
从表1可看出 AB-8大孔吸附树脂对葛根黄酮浸提液原液的吸附量最大，NKA-9次之。说明对葛根总黄酮的树脂柱分离应优先选用弱极性或极性的树脂。这是因为葛根黄酮具有酚羟基和糖苷链，有一定的极性和亲水性，生成氢键的能力较强，这样就有利于弱极性和极性树脂的吸附，而相对于非极性的树脂, 对葛根黄酮的吸附量会偏小。
从表2可以看出，AB-8大孔吸附树脂对葛根黄酮浸提液原液的解吸率无论是在95%乙醇还是在70%乙醇中都较其它3种具有较大值。
3.3 吸附流速对吸附效果的影响吸附流速对吸附效果的影响主要是影响溶质向树脂表面的扩散。如果流速太高，溶质分子来不及扩散到树脂表面，就会发生漏过。
对相同的葛根浸提液在相同条件下，分别进行了AB-8树脂在吸附流速为小流速(2.4 ml/min)，中档流速(4.8 ml/min)、最高流速(8.6 ml/min)的吸附实验，结果见表3。同时比较了这3种情况下的吸附曲线，见图2。
从表3和图2中发现存在如下规律：1）流速快，吸附峰出现早；流速慢，吸附峰出现迟； 2）流速快，峰值回零的时间短； 反之，流速慢，回零的时间也就长；3）流速快，收集的流出液较同时期慢流速收集液吸光度值高，即浓度偏大，泄漏率大些；4）流速快，可以适当增高柱长，加大处理量；流速慢，可采用半柱法，保证实验操作的稳定性。
实验数据表明，随着上柱的吸附原液流速的加快，黄酮类化合物的泄漏越来越严重，吸附流速为8.6 ml/min时泄漏率明显加大，显然此流速不适宜。吸附流速以慢速为好，但过慢会延长生产周期，从而提高成本，故综合考虑，实验时吸附流速控制在2.4 ml/min为宜。表3 吸附流速对吸附效果的影响（略）
3.4 洗脱剂及洗脱浓度的选择黄酮类化合物的水溶液呈弱酸性，可用碱液洗脱；黄酮类化合物易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，可用有机溶剂洗脱。出于不破坏生物活性考虑，一般不用碱液洗脱；甲醇存在毒性，一般不赞成用甲醇作为洗脱液；丙酮有挥发性，洗脱过程不稳定。乙醇无毒又易得，操作方便，可用作葛根总黄酮的洗脱剂。
分别准确配制了30%，60%，70%，90%4种浓度的乙醇洗脱剂，分别检测它们在相同条件下通过树脂柱时的解吸率，结果见表4。其洗脱曲线见图3。
实验发现70%以下乙醇洗脱柱床情况较稳定，70%浓度以上乙醇在洗脱时将产生大量的气泡（放热反应），且气泡产生程度随树脂量、洗脱剂浓度的增加而增长，从而使洗脱时间延长。可以采用的解决办法是在保证树脂饱和吸附的同时，采用半柱法上柱，即降低柱高，增加有效柱高，通过提高液柱比，高位压气，保证洗脱的稳定性。故选用60%乙醇洗脱，其解吸率适中，洗脱浓度也较高，洗脱液总量相应也少，其原因就是在其洗脱过程保持了树脂柱的相对稳定性。同时合理的使用半柱法与高位压柱法，对避免出现“气泡柱”或“空心柱”可起到较好的作用。表4 乙醇洗脱剂浓度对葛根黄酮解吸率的影响（略）
3.5 以“1.2.1”法制备的葛根浸提原液为原料采用4种大孔吸附树脂柱层析分离纯化葛根总黄酮，并分别用“1.2.2”法测定葛根总黄酮含量见表5。表5 柱层析实验数据表（略）
对表5进行分析可以得出以下结论：
4种大孔树脂分离纯化葛根总黄酮以AB-8和NKA-9有较高的得率，洗脱液干重分别为0.043 0 mg和0.045 6 mg。
以60%的乙醇为洗脱液，在2.4 ml/min流速下对AB-8树脂柱进行吸附洗脱，得到的葛根总黄酮（以葛根素计）纯度为53.5%，为最好。
4 小结
树脂柱层析实验中，会出现加入乙醇后柱内气泡大量生成的现象，这将会严重影响实验的稳定性与数据重复性。通过摸索，发现在半柱与高位液压的条件下，60%乙醇洗脱过程稳定性相对突出，并在基础上，对4种较优良大孔吸附树脂在吸附分离纯化葛根黄酮类化合物时的表现进行了比较，发现AB-8大孔吸附树脂在树脂拄层析分离提取葛根总黄酮实验中有最好的表现，是一种结果重复性较好的实验用树脂。以“2.1”方法制备的葛根浸提原液经AB-8大孔树脂分离，当最佳流速为2.4 ml/min，最佳乙醇洗脱浓度为60%时，葛根素收率为25.57%，葛根素纯度由5.50%提高到53.5%。并测定了实验用AB-8树脂的吸附容量为103.2 mg/g。
【参考文献】
［1］许永兴, 瞿海斌.葛根素大孔吸附树脂层析分离动力学［J］.高校化工学报, 2005，19（6）：751.
［2］LIU Huo-an, WANG Bo-chu, DAI Chuan-yun, et al. Optimization of Preparative Separation and purification of Total Flavonoids from Radix Puerariae by Macroporous Resin Method［J］. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 2006, 15 (2)：121.
［3］郑皓. 葛根的研究与开发现状［J］.氨基酸和生物资源，2006, 28(2)：24.
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