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猪星状病毒分离鉴定及其全基因组序列分析和衣壳蛋白原核表达
 
     论文目录
 
摘要第4-6页
ABSTRACT第6-8页
英文縮写对照表第9-10页
目录第10-14页
第一章 综述第14-28页
    1.1 简介第14页
    1.2 AstV病原学特性第14-19页
        1.2.1 分类与命名第14-16页
        1.2.2 形态与结构第16-17页
        1.2.3 基因组结构及特点第17-18页
        1.2.4 病毒非结构及结构蛋白研究进展第18-19页
    1.3 病毒培养特性第19-20页
    1.4 流行病学第20-23页
        1.4.1 人星状病毒第20-22页
        1.4.2 猪星状病毒第22-23页
    1.5 临床症状及致病性第23-24页
    1.6 公共卫生意义第24-25页
        1.6.1 星状病毒基因变异及重组第24-25页
        1.6.2 跨种间传播及人畜共患病潜力第25页
    1.7 SMART 技术第25-26页
    1.8 本研究的目的与意义第26-28页
第二章 猪星状病毒分离和鉴定第28-48页
    2.1 材料与试剂第28-30页
        2.1.1 猪粪便材料第28页
        2.1.2 细胞及猪血清第28页
        2.1.3 主要仪器及耗材第28-29页
        2.1.4 主要分子生物学试剂第29页
        2.1.5 主要培养基及缓冲液配制第29-30页
    2.2 实验方法第30-39页
        2.2.1 样品处理第30-31页
        2.2.2 PAstV检测第31-34页
        2.2.3 目的基因克隆第34-35页
        2.2.4 PK-15细胞复苏与培养第35页
        2.2.5 PK-15细胞胰酶敏感性试验第35-36页
        2.2.6 病毒在PK-15细胞分离培养第36页
        2.2.7 病毒分离鉴定第36-38页
        2.2.8 病毒TCID_(50)的滴定第38页
        2.2.9 分离病毒胰酶依赖性试验第38-39页
    2.3 实验结果第39-45页
        2.3.1 临床猪粪便PAstV病原检测第39-40页
        2.3.2 PK-15细胞TPCK胰酶敏感性试验第40页
        2.3.3 PAstV病毒分离结果第40-45页
    2.4 讨论与分析第45-48页
第三章 猪星状病毒分离株PAstV-GX1全基因组序列扩增与分析第48-71页
    3.1 材料与试剂第48页
        3.1.1 病毒材料第48页
        3.1.2 主要分子生物学试剂第48页
        3.1.3 载体和菌种第48页
    3.2 主要仪器设备第48-49页
    3.3 主要培养基及缓冲液第49页
    3.4 方法与步骤第49-54页
        3.4.1 实验方案设计第49页
        3.4.2 PAstV-GX1 RdRp基因部分片段扩增第49页
        3.4.3 3'RACE-PCR扩增基因组3’端序列扩增第49-51页
        3.4.4 PAstV-GX1全基因组中间部分(ORFla-ORF1b)扩增第51-52页
        3.4.5 5'ACE-PCR扩增全基因组5’端序列第52-54页
        3.4.6 序列测定第54页
        3.4.7 序列编辑第54页
    3.5 实验结果第54-57页
        3.5.1 部分RdRp基因克隆第55页
        3.5.2 PAstV-GX1基因组3’端克隆第55-56页
        3.5.3 ORFla及ORF1b基因扩增第56页
        3.5.4 PAstV-GX1全基因5’端序列扩增第56-57页
    3.6 序列分析第57-63页
        3.6.1 基因组组成第57页
        3.6.2 核苷酸序列特点分析第57-58页
        3.6.3 非结构蛋白氨基酸序列特点分析第58-61页
        3.6.4 同源性分析第61-63页
    3.7 遗传进化分析第63-65页
    3.8 ORF2衣壳蛋白基因免疫原性预测第65-69页
        3.8.1 PAstV1型ORF2推导氨基酸同源性分析第65页
        3.8.2 抗原表位预测分析第65-69页
    3.9 分析与讨论第69-71页
第四章 PAstV-GX1衣壳蛋白原核表达及其反应原性分析第71-90页
    4.1 材料与试剂第71-75页
        4.1.1 毒株,菌种与载体第71页
        4.1.2 主要分子生物学试剂第71-72页
        4.1.3 蛋白质电泳主要试剂及缓冲液的配制第72-73页
        4.1.4 Westerm-blot主要试剂及缓冲液的配制第73页
        4.1.5 蛋白纯化主要试剂及缓冲液的配制第73-74页
        4.1.6 Ni-NTA树脂再生试剂的配制第74-75页
        4.1.7 主要仪器第75页
    4.2 实验方法第75-83页
        4.2.1 实验方案设计第75-76页
        4.2.2 原核表达引物设计第76页
        4.2.3 原核表达载体的构建第76-78页
        4.2.4 原核表达第78页
        4.2.5 SDS-PAGE电泳检测第78-79页
        4.2.6 Western-blot鉴定及原核表达蛋白反应原性初步鉴定第79-81页
        4.2.7 重组表达蛋白表达形式的鉴定第81-82页
        4.2.8 重组表达蛋白纯化第82-83页
        4.2.9 纯化蛋白Wester-Blot鉴定第83页
    4.3 实验结果第83-88页
        4.3.1 原核表达C片段的扩增及克隆第83-84页
        4.3.2 原核表达载体pET-C的酶切鉴定第84-85页
        4.3.3 重组蛋白诱导表达条件优化第85页
        4.3.4 重组蛋白表达形式鉴定第85-87页
        4.3.5 重组蛋白反应原性初步鉴定第87页
        4.3.6 蛋白纯化第87-88页
        4.3.7 纯化蛋白鉴定第88页
    4.4 分析与讨论第88-90页
第五章 全文结论第90-91页
参考文献第91-100页
附录 PAstV-GX1核苷酸序列第100-103页
致谢第103页

 
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