| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 缩略词表 | 第10-15页 |
| 第1章绪论 | 第15-27页 |
| 1.1维生素D3的概况 | 第15-16页 |
| 1.2VD3羟基化合成活性VD3的研究进展 | 第16-17页 |
| 1.2.1化学合成法 | 第16页 |
| 1.2.2微生物转化法 | 第16-17页 |
| 1.3VD3羟化酶简介 | 第17-20页 |
| 1.3.1人体及哺乳动物来源的VD3羟化酶 | 第19页 |
| 1.3.2微生物来源的VD3羟化酶 | 第19-20页 |
| 1.4影响VD3羟基化效率的因素 | 第20-23页 |
| 1.4.1细胞膜的通透性 | 第20-21页 |
| 1.4.2电子传递链的构建 | 第21-22页 |
| 1.4.3辅酶循环系统 | 第22-23页 |
| 1.5基因工程技术在VD3生物催化中的应用 | 第23-24页 |
| 1.6全细胞催化概述 | 第24页 |
| 1.7本文的选题意义及研究内容 | 第24-27页 |
| 1.7.1研究目的和意义 | 第24-25页 |
| 1.7.2主要研究思路和内容 | 第25页 |
| 1.7.3技术路线 | 第25-27页 |
| 第2章羟化酶及其电子传递链基因工程菌的构建与表达 | 第27-41页 |
| 2.1前言 | 第27页 |
| 2.2实验材料 | 第27-29页 |
| 2.2.1菌种、质粒及基因 | 第27-28页 |
| 2.2.2培养基 | 第28页 |
| 2.2.3主要实验试剂 | 第28页 |
| 2.2.4主要实验仪器 | 第28-29页 |
| 2.3重组质粒的构建 | 第29-31页 |
| 2.3.1羟化酶及其电子传递链的选择 | 第29-30页 |
| 2.3.2大肠杆菌感受态的制备 | 第30-31页 |
| 2.3.3重组质粒的验证 | 第31页 |
| 2.4重组表达菌株的构建 | 第31-32页 |
| 2.5目的蛋白的表达与SDS-PAGE分析 | 第32-33页 |
| 2.5.1目的蛋白的诱导表达 | 第32页 |
| 2.5.2细胞破碎 | 第32页 |
| 2.5.3SDS-PAGE电泳分析 | 第32-33页 |
| 2.6实验结果与讨论 | 第33-40页 |
| 2.6.1羟化酶CYP10A1在大肠杆菌中的克隆与表达 | 第33-37页 |
| 2.6.2电子传递链Fdx-Fdr在大肠杆菌中的克隆与表达 | 第37-40页 |
| 2.7本章小节 | 第40-41页 |
| 第3章VD3羟化反应中关键酶的生物学活性分析及羟化过程初探 | 第41-53页 |
| 3.1前言 | 第41页 |
| 3.2实验材料 | 第41-43页 |
| 3.2.1菌种与质粒 | 第41页 |
| 3.2.2培养基及溶液配制 | 第41-42页 |
| 3.2.3主要实验试剂 | 第42页 |
| 3.2.4主要实验仪器 | 第42-43页 |
| 3.3实验方法 | 第43-46页 |
| 3.3.1粗酶液制备 | 第43页 |
| 3.3.2目的蛋白的纯化与SDS-PAGE分析 | 第43-44页 |
| 3.3.3DCPIP评价Fdr对辅酶NAD（P）H的氧化活性 | 第44页 |
| 3.3.4细胞色素C检测Fdx与Fdr的偶联性 | 第44页 |
| 3.3.5CYP10A1与Fdx-Fdr在催化VD3羟化反应过程中的初步研究 | 第44-46页 |
| 3.4实验结果与讨论 | 第46-51页 |
| 3.4.1目的蛋白纯化与SDS-PAGE分析 | 第46-48页 |
| 3.4.2电子传递链的偶联活性研究 | 第48-49页 |
| 3.4.3VD3及羟化产物检测 | 第49-51页 |
| 3.5本章小节 | 第51-53页 |
| 第4章E.coliBL21/pETDuet-1-CYP10A1-Fdx-Fdr工程菌的构建与表达 | 第53-67页 |
| 4.1前言 | 第53页 |
| 4.2实验材料与方法 | 第53-54页 |
| 4.2.1实验所用菌株、质粒及引物 | 第53-54页 |
| 4.2.2主要试剂 | 第54页 |
| 4.2.3主要仪器 | 第54页 |
| 4.2.4培养基和试剂配制 | 第54页 |
| 4.3重组质粒pETDuet-1-CYP10A1-Fdx-Fdr的构建 | 第54-58页 |
| 4.3.1重组质粒pETDuet-1-CYP10A1的构建 | 第55-58页 |
| 4.3.2重组质粒pETDuet-1-CYP10A1-Fdx-Fdr的构建 | 第58页 |
| 4.4菌株E.coliBL21/pETDuet-1-CYP10A1-Fdx-Fdr的构建与表达 | 第58-59页 |
| 4.5实验结果与讨论 | 第59-66页 |
| 4.5.1重组质粒pETDuet-1-CYP10A1筛选与验证 | 第59-62页 |
| 4.5.2重组质粒pETDuet-1-CYP10A1-Fdx-Fdr筛选与验证 | 第62-65页 |
| 4.5.3重组菌株的诱导表达 | 第65-66页 |
| 4.6本章小节 | 第66-67页 |
| 第5章基于全细胞催化的生物转化实验 | 第67-79页 |
| 5.1前言 | 第67页 |
| 5.2主要试剂及配制 | 第67-68页 |
| 5.3实验方法 | 第68-70页 |
| 5.3.1HPLC测定与标准曲线制作 | 第68页 |
| 5.3.2生物催化剂（全细胞）的制备 | 第68页 |
| 5.3.3重组大肠杆菌对VD3的羟基化活性测定 | 第68-69页 |
| 5.3.4助溶剂对VD3羟基化效率的影响 | 第69页 |
| 5.3.5辅酶NADH的添加对VD3羟基化效率的影响 | 第69页 |
| 5.3.6菌体浓度对VD3羟化效率的影响 | 第69-70页 |
| 5.4实验结果与讨论 | 第70-77页 |
| 5.4.1底物和产物的标准曲线绘制 | 第70-71页 |
| 5.4.2重组大肠杆菌对VD3的羟基化活性的测定 | 第71-73页 |
| 5.4.3助溶剂对VD3羟基化效率的影响 | 第73-75页 |
| 5.4.4辅酶NADH的添加对VD3羟基化效率的影响 | 第75-76页 |
| 5.4.5菌体浓度对VD3羟基化效率的影响 | 第76-77页 |
| 5.5本章小节 | 第77-79页 |
| 第6章结论与展望 | 第79-81页 |
| 6.1主要结论 | 第79页 |
| 6.2创新点 | 第79-80页 |
| 6.3不足与展望 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-91页 |
| 在校期间论文发表情况 | 第91-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
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