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骨髓CD34+干细胞种植人工血管应用于血管置换后血清中6-k-PGF1α
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【西医学评职论文】作者：李光新，胡三元，于振海，张曙光，王坤，时昌文，廉维帅 【摘要】 目的 研究骨髓CD34+细胞分别种植于人工血管后血清6-k-PGF1α和TXB2的变化情况，并探讨其与新生内膜增生、血栓形成的关系。方法 选杂种犬12条，依人工血管不同分为ePTFE血管实验组(4条)和涤纶血管
作者：李光新，胡三元，于振海，张曙光，王坤，时昌文，廉维帅
【摘要】 目的 研究骨髓CD34+细胞分别种植于人工血管后血清6-k-PGF1α和TXB2的变化情况，并探讨其与新生内膜增生、血栓形成的关系。方法 选杂种犬12条，依人工血管不同分为ePTFE血管实验组(4条)和涤纶血管实验组(4条)及ePTFE对照组(2条)和涤纶对照组(2条)，实验犬采自体骨髓，提取CD34+细胞种植覆膜人工血管，对照犬采用单纯自体血预凝人工血管，手术将血管植入同一条犬的下腔静脉和腹主动脉。在术前、术后3天、7天、14天、30天、60天时股静脉采血测定血小板，血清PGF1α、TXB2浓度和PGF1α/TXB2的比值，并在60天时获取全部人工血管标本，光镜和电镜观察新生内膜增生和血栓形成情况。结果 实验组血小板和TXB2浓度先上升后下降并维持在一定水平，而对照组明显上升后维持在一个较高水平。实验组血清PGF1α和P/T的比值先降低后升高，而对照组明显降低后维持在一个较低水平;对照组新生内膜较实验组明显增生，并有血栓形成。结论 骨髓CD34+干细胞种植人工血管应用于血管置换后能有效抑制PGF1α和P/T比值的过度降低、TXB2和血小板的过度升高，从而抑制内膜的过度增生和血栓形成。
【关键词】 人工血管 CD34 骨髓 前列环素 血栓素B2
[Abstract] Objective To investigate the relationship between the 6-Keto-PG F1α，TXB2 and the endotheliosis and thrombosis of the new endomembrane on the prostheses seeded by CD34+ stem cells.Methods Twelve dogs were randomized into two groups.Prostheses covered with ePTFE or Dacron were implanted into the abdominal aorta(AA) and inferior vena cava (IVC).In each group，6 dogs were implanted by prostheses seeded by CD34+ stem cells，4 dogs were implanted by autogenous blood only as control.The blood was collected in preoperative and 3，7，14，30，60 days postoperative from femoral vein.Light and electron microscopy were applied to observe the endotheliosis and thrombosis of the new endomembrane when harvesting all the prostheses in the 60 days.Results The levels of the platelet，6-Keto-PGF1α，TXB2 and P/T in experimental group was significantly different than the control group. The thickness of new endomembrane in control group was notablely different than the experimental group.Conclusion It can restrain the lower levels of 6-Keto-PGF1α and P/T and the higher concentration of TXB2 platelet in experimental group and then inhibit endotheliosis and thrombosis in the prostheses covered with ePTFE or Dacron that are implanted by CD34+ stem cells than the controls.
[Key words] prostheses;CD34;bona marrow;prostacyclin;thromboxane B2
血管旁路术后血管壁内膜的损伤，能引起血流动力学改变、血小板的激活和细胞因子的释放，造成内膜的反应性增生，常可引起术后中晚期的狭窄或闭塞[1]。骨髓CD34+干细胞种植人工血管应用于血管置换，可有效并尽早形成内膜，防止术后内膜过度增生致狭窄或闭塞。本文检测血清中6-k-PGF1α
和TXB2的变化情况更进一步说明了骨髓CD34+干细胞种植人工血管应用于血管置换可能有防止内膜增生和血栓形成的作用。
1 对象与方法
1.1 血标本采集及观察指标 选杂种犬12条，依人工血管不同分为ePTFE血管实验组(4条)和涤纶血管实验组(4条)及ePTFE对照组(2条)和涤纶对照组(2条)，每只犬在术前和术后3、7、14、30、60天股静脉采血分别放入按要求加入相应抗凝剂的3个不同试管中。应用酶免疫测定(enzyme immunoassay，EIA)方法测定PGF1α、TXB2的浓度，并计算PGF1α、TXB2的比值。PGF1α试剂盒(Lot No.0406334)TXB2试剂盒(Lot No.0405850)均由美国Cayman Chemical Company提供，方法步骤按说明书。
1.2 方法 骨髓采集和CD34+细胞的分离，人工血管预凝，内皮化人工血管植入犬的下腔静脉和腹主动脉，术后内皮化人工血管检测。具体步骤见相关文献[2]。
1.3 统计学分析 采用统计软件包为 SPSS 13.0。实验数据以均数±标准差(x±s)表示，结果用t检验处理。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血小板(PLT)、PGF1α、TXB2和P/T的比值 见表1~4。表1 两组患者手术前后PLT比较表1说明术后3天由于术中失血和术后血容量恢复后血液稀释，两组血小板没有明显变化。术后1周以后由于血小板黏附与大量激活，对照组较实验组明显升高(P<0.05)。 表2 两组患者手术前后PGF1α比较表2说明在术后7天内由于形成的内皮细胞数相对较少产生PGI2较少，两组PGF1α的浓度没有明显变化;术后7天由于新生内皮细胞合成PGI2增多，实验组较对照组明显升高(P<0.05)。表3 两组患者手术前后TXB2比较表3说明由于血管损伤没有得到及时修复，血小板激活，释放反应增强，血栓素合成明显增加而实验组形成的内皮细胞有一定的保护作用，术后3天后对照组TXB2较实验组明显升高(P<0.05)。表4 两组患者手术前后P/T比值比较 表5 2个月对照组及实验组新生内膜厚度表4说明由于实验组新生的内皮细胞的保护作用有效抑制PGF1α的降低和TXB2的过度升高，术后3天后实验组P/T较对照组有明显的变化(P<0.05)。
2.2 测量内膜厚度 表5说明实验组无论是动脉还是静脉内膜增生的厚度都明显小于对照组(P<0.05)。
2.3 扫描电镜观察 60天时，涤纶人工血管的新生内膜覆以较完整内皮细胞层，这些细胞排列紧密，细胞走行与血管长轴一致。ePTFE血管新生内膜流入道吻合口处新生内膜较流出道吻合口处的新生内膜完整，中段内皮细胞分布稀疏但基本覆盖管壁，表面附着纤维素和血细胞，其间见坏死和衰老的内皮细胞(图1、2)。对照组人工血管内膜表面无内皮细胞覆盖，仅见血小板沉积形成的血栓及纤维组织排列(图3、4)。
3 讨论 各种血管成形术、血管旁路术使血管内皮损伤后，血小板黏附到损伤部位，聚集并活化，诱导产生生长因子、细胞因子、黏附分子、趋化因子等生物活性物质，包括血小板源生长因子(platelet-derived growth factor
3 讨论
各种血管成形术、血管旁路术使血管内皮损伤后，血小板黏附到损伤部位，聚集并活化，诱导产生生长因子、细胞因子、黏附分子、趋化因子等生物活性物质，包括血小板源生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、转化生长因子(transforming growth factor-beta， TGF-beta)、5-羟色胺(serotonin)、血栓素A2(thromboxane A2)、P-选择素(selectin)、组胺(histamine)、白细胞介素(IL-6、IL-8)等[3]。本研究结果显示术后3天所有对象的血小板计数都较术前低，可能是由于术中失血和术后补充血容量后血液稀释有关。术后7~60天，实验组血小板升高明显低于对照组，可能由于对照组血管内膜的损伤加上没有内皮细胞的内膜直接接触血液刺激血小板的聚集、黏附、活化并大量合成有关;而骨髓CD34+干细胞种植人工血管后的实验组由于快速内皮化而有了内皮细胞的保护，血小板不会大量黏附并沉积，从而减少了术后血栓的形成，从而使实验组有抗血栓的作用。
血管内皮细胞可产生前列环素、腺苷、一氧化氮、VEGF等生物活性物质，具有阻止炎症细胞黏附、血栓形成、抑制平滑肌细胞增殖的作用[4]。多种因素可以损伤内皮细胞，造成内皮细胞功能紊乱(endothelial dysfunction)或功能丧失，导致内皮抗炎因子减少，诱导血管内膜增生。前列环素(ProstaglandinI2，PGI2)为花生四烯酸代谢产物，主要在血管内皮细胞和肾皮质内生成，具有抑制血小板聚集、舒张血管的作用[5，6]。PGI2不稳定(半衰期为2~3 min)，迅速分解为6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)[7]。由于PGI2半衰期短，性质不稳定，易于转化成稳态的6-Keto-PGF1α，因此以6-K-PGF1α间接反映GI2水平。本实验所有研究对象6-Keto-PGF1α先下降提示血管内皮细胞损伤，前列环素酶减少，合成PGI2相应减少;然后上升表明内皮损害进程中，能量代谢障碍，花生四烯酸蓄积，在TXA2大量升高的同时，PGI2亦随之上升[8]。而实验组6-Keto-PGF1α的含量比对照组明显升高可能与骨髓CD34+干细胞种植人工血管后新生血管内皮的形成有关，新生血管内皮细胞合成PGI2，亦可导致PGI2增高。可见骨髓CD34+干细胞种植人工血管后形成的新内皮细胞有增加PGI2合成的作用，从而抑制术后内膜的过度增生。
血栓素A2(Thromboxane A2，TXA2)以血小板产生为主，它可诱导血小板聚集，血管平滑肌的收缩，并能与其他活性物质共同刺激VSMC迁移和增殖[9]。TXA2不稳定(半衰期为5~7 min)在血液中迅速分解为血栓素B2(TXB2)，然后通过肾脏排出[10]。由于TXA2半衰期短，性质不稳定，易于转化成稳态的TXB2，因此多以TXB2间接反映TXA2水平。本实验所有研究对象TXB2水平呈明显升高趋势，表明血小板激活，释放反应增强，血栓素合成明显增多;对照组TXB2水平较实验组明显升高可能由于血管内膜的损伤，血小板黏附到损伤部位，聚集并活化，诱导产生血栓素A2等生物活性物质。骨髓CD34+干细胞种植人工血管后的实验组，由于新生内皮细胞的保护作用，抑制血小板的激活和黏附，对血栓素的合成起一定的抑制作用，同时还由于有PGI2升高的拮抗作用使实验组TXB2升高水平明显低于对照组。
正常情况下，PGI2和TXA2二者互为拮抗，构成动态平衡，维持血管正常舒缩及血小板内环境的稳定[11]。当血管手术或血管内膜粥样硬化等可能引起血管内皮细胞(endothelial cell)的损伤，使之产生PGI2的能力下降。在受损的血管内皮黏附血小板及脂质过氧化的参与下，进一步刺激血小板合成并释放大量TXA2入血，黏附更多的血小板形成血栓[12]。PGI2/TXA2比值的降低又可诱发白细胞附壁，炎性浸润，纤溶活性降低，并促进血管内皮释放生长因子，刺激成纤维细胞，平滑肌细胞增生或迁移，从而使血管内膜过度增生。TXA2和PGI2互为生理拮抗剂，T/P之间的动态平衡在维持血管稳态上起着重要作用，因此衡量它们对血管作用时应用T/P比值的改变更为合理[13]，而两者的比值更能反映出新生的内皮细胞不仅具有抗血栓的作用，也有抑制新生内膜增生的作用。
60天取材的人工血管扫描电镜观察，对照组人工血管内膜表面仅见血小板沉积形成的血栓及纤维组织排列而无内皮细胞覆盖，而实验组人工血管内膜表面却有走行与血管长轴一致的较完整的内皮细胞层。从而再次验证了骨髓CD34+干细胞种植人工血管应用于血管置换后新生内膜能有效抑制内膜的过度增生和血栓形成所致的血管狭窄或闭塞。
总之，骨髓CD34+干细胞种植人工血管应用于血管置换后快速内皮化能有效阻止炎症细胞黏附、阻止血小板对多种活性物质的释放、抑制平滑肌细胞增殖与迁移，从而抑制血管内膜的过度增生。新生的血管内皮细胞还可产生前列环素、腺苷、一氧化氮、VEGF等生物活性物质，具有阻止血栓形成作用。骨髓CD34+干细胞种植人工血管应用于血管置换可能为以后人工血管内皮化的临床应用提供一种简便实用的方法，以降低血管旁路术后内膜过度增生和血栓形成所致的血管狭窄或闭塞。
【参考文献】
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13 孙建玲，张一梅，刘大娟，等.实验性大鼠肺血栓栓塞前后血浆TXA2，PGI2和T/P变化及意义.中国伤残医学，2007，15(3):7-8.
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