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抗人硫氧还蛋白1单克隆抗体的制备与鉴定及初步应用
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【中医学毕业论文】作者：唐文心, 王建和, 陈正望, 陈孝平【摘要】 目的: 制备抗硫氧还蛋白1（TRX1）的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法: 以原核表达的TRX1为抗原免疫BALB/c小鼠, 按常规方法进行细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA法克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株, 用ELISA 检测mAb腹水的效价、 相对亲和力和进行表位分析, 用Western blot法对mAb的特异性进行鉴定。结果: 得到筛选出3株能稳定分泌抗TRX1的杂交瘤细胞株B6、 D5和E3, 免疫球蛋白亚类均为IgG1 (κ), 腹水mAb效价均在106以上, 3株抗体分别针对不同抗原表位。用mAb建立的竞争抑制ELISA灵敏度达1.22 μg/L。结论: 获得3株特异性好、 亲和力高、 能稳定分泌抗TRX1的杂交瘤细胞株, 为研究TRX1在人类细胞、 血液、 组织中的表达及定位提供了可能, 并为探索相关炎症、 癌症发病机制及新治疗方法提供了强有力的工具。
【关键词】 人硫氧还蛋白 1 单克隆抗体 竞争抑制ELISA
硫氧还蛋白1（thioredoxin1, TRX1）相对分子质量（Mr）约为12 000, 属于进化保守的氧化还原蛋白家族, 具有活性中心(TrpCysGlyProCysLys), 它与TRX1还原酶和 NADPH共同构成调节细胞氧化还原状态的巯基氧化还原系统（TRX系统）。1964年TRX1在大肠杆菌中首次被发现至今［1］, 被证实广泛存在于原核、 真核生物中, 具有多种重要功能, 如抑制细胞凋亡、 增加转录因子活性, 刺激细胞增殖及血管生成, 作为DNA合成的辅助因子［2］。临床研究发现, 在氧化应激及炎症状态下包括HIV感染、 类风湿性关节炎、 Sjogren’s综合症、 急性冠状动脉综合征和扩张性心肌病等, 患者血清中TRX1水平将大大提高。更有趣的是, 许多人类恶性肿瘤中均发现TRX1的过表达, 包括肺癌、 直肠癌、 肝癌、 胰腺癌、 胃癌、 乳腺癌、 淋巴癌等［3］, 故将TRX1作为一项病理指标并提示可将TRX1及TRX1系统作为癌症治疗的新靶点, 具有潜在的应用价值。
1 材料和方法
1.1 材料 表达载体pET32a, pcDNA3.1(+)大肠杆菌 DH5α和BL21, 人乳腺癌细胞MCF7细胞株由本实验室保存。 MMLV反转录酶, DNA限制性内切酶, T4 DNA ligase, Klenow酶, pfu聚合酶和 dNTP购自TaKaRa公司。IPTG酵母提取物及胰蛋白胨为 OXOID公司产品。肌动蛋白（βactin）及其单克隆抗体（mAb）、 微管蛋白（βtublin）及其mAb、 牛血清白蛋白（BSA）、 BCA试剂盒及DMEM培养基均为Sigma公司产品。弗氏佐剂为Gibco BRL公司产品。4～6周龄雌性BALB/c小鼠（体质量18～22 g）购自湖北省实验动物研究中心。Sp2/0细胞由中国农业大学传染病与微生物学教研室提供。酶联免疫检测仪为Labsystems dragon公司产品。Sephadex G25凝胶柱为Phamarcia产品。IgG 亚类（型）ELISA检测试剂盒为Pierce公司产品。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 TRX1的原核表达及纯化 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物对: P1 5′CGGAATTCAATGAACGGCCCTGAAGATCT3′; P2 5′CGGAATTCTCAGCAGCCAGCCTGGAGGA3′。提取人乳腺癌细胞MCF7总 RNA, 用MMLV反转录成cDNA, 以此cDNA为模板, P1和P2作为引物, 用高保真DNA聚合酶pfu进行扩增, 反应程序为: 94℃ 30 s, 55℃ 60 s, 72℃ 40 s, 循环30次。其产物和pcDNA3.1(+)载体连接得到pcDNATRX1。使用Kpn I和Xho I将从pcDNATRX1上将TRX1基因切下后克隆到pET32a的相同位点中, 得到原核表达载体pET32aTRX1。提取pET32aTRX1质粒转化大肠埃希菌 BL21工程菌, 以单菌落接种于 LB培养基（含氨比西林50 mg/L）中振荡培养过夜, 1%转接后继续振荡培养至A值为0.5, 加0.4 mmol/L IPTG诱导表达。将 BL21重悬于预冷的Tris缓冲液（pH7.9, 含5 mmol/L咪唑, 0.5 mol/L NaCl和20 mmol/L TrisHCl）中, 加入10 g/L Triton X100后超声破碎, 12 000 g, 10 min离心后取上清。将超声后的上清以15 mL/h的速度过Ni亲和柱, 再用20倍柱床体积的PBS（含0.5 mL/L Tween20）洗柱3次, 以洗脱杂蛋白, 再加入100 μg/unit thrombin蛋白酶于22℃轻柔振荡16 h, 用8 mL的PBS洗脱, 收集洗脱液。再用100 mmol/L咪唑洗脱标签蛋白。
1.2.2 免疫原BSATRX1的制备 参考文献［ 4］, 将10 mg BSA溶于0.1 mol/L碳酸盐缓冲液(CB, pH9.0, 含9 g/L NaCl和1 g/L SDS)中, 加入2.5 g/L戊二醛水溶液20 μL, 避光反应1 h。反应液流经Sephadex G25凝胶柱以除去未反应的戊二醛, 0.1 mol/L pH9.0 的CB洗脱, 收集蛋白洗脱峰。在洗脱液中加入2 mg TRX1, 避光反应16 h后, 加入终浓度为1 mol/L的甘氨酸终止反应6 h。将反应液放入截流Mr为3 000的透析袋中, 于 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）中透析24 h, 每3～4 h换液1次, 最后用BCA法测定蛋白浓度, 冻干, -20℃保存。
1.2.3 杂交瘤细胞建立和腹水制备及抗体纯化 将BSATRX1加弗氏完全佐剂乳化后, 经背部皮下多点注射BALB/c小鼠, 100 μg/只。免疫后第28、 40及第52天, 将BSATRX1与弗氏不完全佐剂乳化后, 以上述途径各加强免疫1次, 50 μg/只。于融合前3～4 d, 再以50 μg/只的BSATRX1不加佐剂经腹腔注射加强免疫1次。细胞融合、 筛选、 克隆化、 腹水制备及抗体纯化均按常规方法进行, 其中抗体的纯化使用辛酸硫酸铵沉淀法［5］。
1.2.4 mAb的特性鉴定 (1)mAb的Ig亚类（型）: 采用ELISA检测试剂盒进行鉴定。(2)腹水mAb的效价: 采用间接ELISA检测。37℃孵育后, 用10 g/L的明胶封闭, 将腹水做1∶102 ～ 1∶108稀释后, 加入到4 mg/L TRX1包被的酶标板中, 反应1 h后, 洗涤, 加入辣根过氧化物酶标记（HRP）的羊抗小鼠IgG抗体, 加底物显色后, 测定各孔的A492值。(3)mAb亲和力测定: 分别用1.0 mg/L、 2.0 mg/L、 5 mg/L的TRX1包被酶标板, 间接ELISA法测定各孔的A492值。然后以细胞上清中mAb的浓度为横坐标, 以其相应的A值为纵坐标, 绘制3条测定曲线, 以各曲线上部趋于平坦的A值为100%, 计算A值为50%时的mAb的浓度［Ab］t, 这样每份被检样品可得［Ab］t1、［Ab］t2、 ［Ab］t3三个值, 然后根据文献［5］公式计算出其亲和常数。(4)mAb在Western blot中的应用: 检测TRX1标准品, BSA为阴性对照, 其中一抗工作浓度为1∶10 000; 羊抗鼠IgG（二抗）工作浓度为1∶5 000。(5)mAb的表位分析: 采用间接ELISA相加实验。根据腹水mAb的效价, 将3株腹水分别稀释至饱混和时的工作浓度, 在此浓度下各取50％两两混匀。分别测定混和的mAb及饱和浓度下3株腹水mAb的A492值。计算加成指数AI=［2A1+2/(A1+A2)-1］×100%。式中A1、 A2分别为2株不同mAb所测的A492值, A1+2为两两混和抗体所测的A492值。每组重复实验3次, 计算其平均值, AI值大于50％即认为两种mAb识别不同的抗原表位。
1.2.5 竞争性抑制ELISA的建立 参照文献［5, 6］的方法, 在按常规ELISA 方法包被和封闭酶标板后, 将TRX1、 BSA和戊二醛标准品以20 mg/L 溶于抗体稀释液中, 并进行倍比稀释［7］, 共15个稀释梯度, 第16孔以抗体稀释液作为阴性对照, 各取50 μL, 另将纯化的mAb D5（0.33 mg/L）50 μL与标准抗原、 抗体稀释液充分混合后, 室温反应30 min, 加入到酶标板中, 100 μL/孔, 37℃孵育1 h; 洗涤, 加入适宜浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体, 100 μL/孔; 洗涤, 加入底物邻苯二胺(OPD)溶液, 100 μL/孔, 37℃闭光显色20 min。用50 μL/孔2 mg/L H2SO4终止反应后, 测定各孔的A492值。
另外在按普通ELISA 方法包被和封闭酶标板后, 将TRX1标准品从10 mg/L作倍比稀释, 共16 个稀释梯度, 同时将1 g/L纯化的mAb D5作1∶5 000 稀释。将二者等体积充分混合后, 室温反应15 min, 加入到酶标板中。然后再加入酶标二抗37℃ 1 h, 加入底物显色。检测结果用Microcal Origin 6.0软件进行分析。
以各质量浓度TRX1 (包括0 μg/L)的A492值转换成B/B0％, 其中无TRX1抑制时的A492值为B0, 各相应质量浓度的TRX1抑制时的A492值为B, 因为B/B0％值与lgTRX1成线性回归关系, 从而可计算回归曲线的方程与相关系数。
1.2.6 检测不同刺激下MCF7细胞中TRX1的变化 6孔板中MCF7乳腺癌细胞培养至密度约为70％后, 先对4孔细胞做四种不同处理, 分别为向DMEM培养基中加入100 μmol/L 过氧化氢（H2O2）, 10 μmol/L 三氧化二砷（As2O3）, 200 μmol/L 过硫酸铵（APS）和40℃下孵育30 min, 再将细胞正常孵育24 h, 提取细胞总蛋白［8］, 用Western blot检测TRX1含量。其中一抗工作浓度为1∶10 000; 羊抗鼠IgG（二抗）工作浓度为1∶5 000。
2 结果
2.1 TRX1的制备和纯化 含重组质粒的工程菌经IPTG诱导, 获得了重组蛋白的高效表达, SDSPAGE分析中重组蛋白出现在Mr 14 000的位置, 与目的蛋白的理论Mr大小相符按Ni亲和柱的说明书进行融合蛋白的纯化, 并且用Thrombin酶作用后对各步骤和洗脱液进行常规SDSPAGE电泳, 电泳结果表明, 得到了较纯的目标蛋白TRX1, 用Bradford的方法测得其浓度约为1 g/L（图1）。
图1 融合蛋白酶切纯化分析（略）
1: 重组人TRX1(Mr 13 000); 2: 标签蛋白(Mr 16 000); 3: pET32aTRX1未经IPTG诱导; 4: pET32aTRX1经IPTG诱导; 5: Protein marker.
2.2 杂交瘤细胞株的建立及mAb的特性鉴定 获得3株可稳定分泌抗TRX1 mAb的杂交瘤细胞, 分别命名为B6、 D5及E3, 均为IgG1（κ）; 腹水mAb 的效价及亲和常数见表1。Western blot检测说明, mAb可特异性地识别重组蛋白TRX1和细胞MCF7中的天然蛋白TRX1(图2)。分别计算3株mAb两两相加实验的结果, AI(B6＋E3)＝87％, AI(B6＋D5)＝86％, AI(D5＋E3)＝83％, 均大于50％, 说明3株抗体均针对不同表位。
表1 3株抗人硫氧还蛋白1部分特性的鉴定（略）
图2 mAb的Western blot分析（略）
1: MCF7 细胞总蛋白, βactin为内参; 2: 重组TRX1蛋白; 3: BSA 作为阴性对照.
2.3 竞争抑制ELISA的建立 根据B/B0％, 再对IgTRX1进行回归分析（图3）, 得到回归方程为y=6.15863-19.39975x, R＝-0.99033, R2=0.9808, 符合线性关系的判断标准, 其中y为B/B0％, x为IgTRX1, 故最低测限为1.22 μg/L, 最佳检测范围为12～600 μg/L。
图3 TRX1抑制竞争ELISA检测标准曲线（略）
2.4 不同刺激下MCF7细胞中TRX1表达的变化 Western blot检测发现, 与对照相比, 在用100 μmol/L 过氧化氢（H2O2）, 10 μmol/L三氧化二砷（As2O3）诱导的MCF7细胞中, TRX1的表达上升了, 而用200 μmol/L 过硫酸铵（APS）和40℃ 30 min诱导的细胞中TRX1的表达下降了（图4）。
图4 Western blot检测MCF7细胞中总TRX1水平（略）
1: 对照, 未经处理; 2: 经200 μmol/L APS诱导; 3: 经100 μmol/L H2O2诱导; 4: 40℃下孵育30 min; 5: 经10 μmol/L As2O3诱导; βtublin为内参.
3 讨论
大量研究显示TRX1具有多种生物学功能, 除了具抗氧化活性, 能去除细胞内多余活性氧（ROS）和毒性物质特别是氧化剂和亲电子试剂干扰［9］, 还作为DNA合成的辅助因子刺激细胞增殖及血管生成; 与细胞凋亡信号调节激酶1(ASK1)结合阻碍细胞凋亡下游信号通路, 抑制细胞凋亡; 促进低氧诱导因子1（HIF1）的表达和对化学治疗的耐受力; 在氧化还原信号通路中调节多种转录因子, 包括核NFKB、 AP1和p53［10］。大量实验表明, 在氧化应激及炎症状态下以及HIV感染、 类风湿性关节炎等, 患者血清中TRX1水平将大大提高。更有趣的是, 许多人类恶性肿瘤中均发现TRX1的过表达, 包括肺癌、 直肠癌、 肝癌、 胰腺癌、 胃癌、 乳腺癌、 淋巴癌等。因此, 对TRX1做进一步研究将有助于人们对多种疾病（包括肿瘤等）发生, 发展过程的理解。
因TRX1 Mr 约为12 000, 仅含105个氨基酸, 免疫原性可能较低, 与大分子的载体蛋白交联才能更好地刺激机体产生免疫应答。故我们用戊二醛两步法将TRX1交联在BSA上, 用BSATRX1作为免疫原制备mAb, 以提高其免疫原性。用TRX1直接作为筛选阳性杂交瘤细胞的包被抗原, 通过竞争抑制ELISA 检测, 筛选出来的阳性杂交瘤细胞分泌的3 株mAb 都是只针对TRX1, 而同BSA不出现结合反应。Western blot结果显示mAb能识别MCF7细胞中的TRX1和重组TRX1, 证明抗TRX1 mAb 的特异性好。建立的ELISA检测方法的敏感性满足检测人血清中TRX1含量的要求, 对实现对TRX1的快速、 准确的定量试剂盒的开发提供了可能。很多研究证明TRX1抑制凋亡, 如TRX1可以抑制顺铂诱导的胰腺癌细胞的凋亡［11］。但是也有不一致的报道, 如恶性间皮细胞瘤细胞中TRX1对凋亡的作用也不明显［12］。Western blot结果显示, 在诱导细胞凋亡的过程中, 有的诱导剂使TRX1表达增强了, 有的诱导剂则会使TRX1表达量下降。细胞凋亡进程中TRX1表达量出现了相反的表现, 这似乎表明TRX1不是细胞凋亡的必要信号通路, 它可能只能在特定的细胞中针对特定的诱导剂而发挥其抗凋亡的功能, 其分子机制还需要进一步的深入研究。TRX1及其mAb的成功制备, 为进一步研究TRX1在人类细胞、 血液、 组织中的表达及定位提供了可能, 并为探索相关炎症、 癌症发病机制及新治疗方法提供了强有力的工具。
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