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PBK/TOPK在TPA诱导的人HL其它医学

【中药学类毕业论文】【关键词】 HLExpression and significance of PBK/TOPK in differentiation of human HL60 leukemic cells induced by TPA
【Abstract】 AIM: To investigate the expression and significance of PBK/TOPK in the differentiation of human HL60 leukemic cells induced by TPA. METHODS: After induction of TPA, WrightGiemsa staining was performed to observe the morphological changes of HL60 cells and flow cytometry was used to observe the cell cycles and the expressions of CD11b, CD14, CD13, CD33, respectively. Expression of PBK/TOPK was detected by Western Blot. RESULTS: After the treatment with 5.1 nmol/L TPA for 3 d, the number of NBT positive cells and the expressions of CD11b, CD13 and CD14 increased, and the expression of PBK/TOPK decreased. CONCLUSION: TPA can inhibit the proliferation of HL60 cells and induce the differentiation of HL60 cells into the granulocytic or monocytic lineage. During the process, PBK/TOPK expression is downregulated and the expression of PhoPBK/TOPK is upregulated.
【Keywords】 HL60 cells; PBK/TOPK; cell differentiation; phorbol exters
【摘要】 目的: 研究 PBK/TOPK在TPA(佛波酯)诱导白血病细胞HL60的分化时的表达及意义. 方法 : 细胞化学染色法观察药物作用后细胞形态的变化;流式细胞仪检测药物对HL60细胞周期及细胞表面分化抗原CD11b, CD14, CD13和CD33表达的 影响 ;用western Blot法检测PBK/TOPK在HL60细胞分化前后表达的变化. 结果: 经5.1 nmol/L TPA处理72 h后,NBT阳性细胞数和CD11b, CD13, CD14表达是增加的,HL60细胞体积缩小,核浆比例减低,核仁减少甚至消失,核形态扭曲折迭或分叶;PBK/TOPK在HL60细胞向成熟分化后表达下调. 结论: TPA能抑制白血病细胞HL60的增殖,并诱导其向成熟单核、粒细胞分化,在此过程中,PBK/TOPK表达是下调的,但PhoPBK/TOPK的表达是增加的.
【关键词】 HL60细胞;PBK/TOPK;细胞分化;佛波醇酯类
  0引言
白血病是严重威胁人类特别是青少年生命的恶性肿瘤,深入研究白血病的发病机制为彻底治愈它提供希望. 近来研究表明信号转导通路的异常参与了肿瘤的发生[1]. PBK/TOPK是MAPKK家族新的成员,主要表达于人的睾丸、胎盘、心肌组织、胰腺,并在多种Burkitt淋巴瘤系和1例急性淋巴细胞白血病中表达上调[2]. 我们以急性粒细胞系HL60细胞为研究对象,探讨PBK/TOPK在佛波酯(TPA诱导HL60分化机制中的作用,以期为白血病的基础研究和临床 治疗 提供一条有效的途径.
  1材料和方法
1.1材料人急性髓细胞白血病细胞株HL60由本室保存. PBK/TOPK为美国Cell signal technology公司产品,新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司,硝基蓝四氮唑(NBT)为Promega公司产品,佛波酯(TPA)为美国Sigma试剂公司产品. 小鼠抗人CD11b, CD13, CD33和CD14 FITC荧光标记的mAB购自Immunotech公司.
1.2方法
1.2.1细胞培养细胞培养于含体积分数为100 mL/L灭活小牛血清的RPMI1640培养液,置37℃、饱和湿度、50 mL/L CO2培养箱中悬浮培养. 2~3 d换液1次. 实验所用细胞处于对数生长期.
1.2.2NBT还原阳性率测定离心收集单独培养的对照组及与5.1 nmol/L TPA作用3 d的HL60细胞,重悬于培养液中(细胞密度1×106/L),加入终浓度为1 g/L NBT及100 μg/L TPA, 37℃, 50 mL/L CO2培养箱中孵育1 h,离心收集细胞涂片,进行WrightGiemsa染色,油镜下观察200个细胞,胞质内有蓝紫色颗粒的细胞为NBT阳性细胞, 计算 阳性细胞率.
1.2.3流式细胞仪测定细胞周期分别收集TPA诱导前后的两组HL60细胞,各组细胞1×106个,制成细胞悬液,PBS洗涤2次,离心去上清,加入1 mL PBS和2 mL无水乙醇固定1 h,再次洗涤后,加入DNAPrepstain染液染色,用流式细胞仪(德国BD公司)检测各组细胞的细胞周期时相的荧光强度,用DNA Multi Cycle软件进行统计学拟和 分析 .
1.2.4免疫荧光检测细胞膜表面抗原制备各实验组及对照组活细胞悬液100 μL(细胞数为1×106个细胞),分别加入小鼠抗人CD11b和CD13, CD14, CD33FTTC荧光标记的mAb工作液10, 20, 20, 20 μL和正常兔血清5 μL封闭,充分混匀后室温避光放置30 min,洗涤液(DPBS,50 mL/L FCS和2 g/L NaN3)洗2次×5 min后,弃上清,加入终浓度20 g/L的多聚甲醛固定液500 μL重悬细胞,流式细胞仪(FCM)检测.
1.2.5Western Blot按分子克隆方法[3]分别提取各组细胞总蛋白,经紫外分光光度法定量后,各组取等量总蛋白进行10% SDSPAGE电泳并转移到PVDF膜上,膜用50 g/L脱脂奶粉封闭1h,加入PBK/TOPK多抗体(1∶800)4℃过夜,TBST洗膜,生物素化的羊抗兔IgG二抗37℃温育1 h,TBST洗膜后DAB显色.
统计学处理:实验结果以x±s表示,组间比较采用SPSS10.0软件包进行t检验,P<0.05有统计学意义.
  2结果
2.1TPA诱导后HL60细胞形态改变5.1 nmol/L TPA诱导HL60细胞3 d后,HL60细胞体积减小,核浆比例减低,核仁变的模糊甚至消失,核染色质由疏松趋向致密,核形态扭曲折迭或分叶,胞质趋向成熟改变(图1).
2.2NBT还原率的变化5.1 nmol/L TPA诱导HL60细胞3 d后,NBT阳性细胞数增至(39.12±4.87)%, n=3,与HL60单独培养对照组(3.67±1.08)%相比升高(P<0.05).
2.3TPA诱导后HL60细胞周期的变化经FCM检测, 5.1 nmol/L TPA诱导HL60细胞3 d后,G1期细胞百分比由51.9%增加至85.6%,S期细胞由44.5%减少至8.9%(图2).
图1佛波酯(TPA)诱导人急性髓细胞白血病HL60细胞的形态学变化 略
图2佛波酯(TPA)诱导人急性髓细胞白血病HL60细胞周期 略
2.4HL60细胞表面抗原表达变化对照组HL60细胞CD11b, CD13和CD14的表达率分别为10.9%, 6.9%和18.9%,经5.1 nmol/L TPA诱导3 d后,分别增至96.4%,53.7%和71.1%,变化有统计学意义. 而CD33处理前后无统计学变化.
2.5TPA诱导HL60细胞后PBK/TOPK蛋白表达的改变Western印迹显示,TPA诱导HL60细胞3d后,PBK/TOPK蛋白表达下降,磷酸化的PBK/TOPK表达少量增加(图3).
图3TPA诱导HL60细胞PBK/TOPK蛋白表达变化 略
  3讨论
肿瘤细胞的增殖能力与肿瘤细胞的分化程度密切相关,分化程度差的细胞往往比分化程度好的细胞增殖活跃,因此可以通过降低细胞增殖,诱导肿瘤细胞向成熟细胞方向分化以达到 治疗 肿瘤的目的. NBT还原实验和表面分化抗原的检测两个实验的结合广泛用于白血病诱导分化实验的 研究 [4]. 我们用TPA诱导HL60细胞体外分化,观察到NBT阳性细胞增多,细胞由分散变黏附贴壁生长,CD11b, CD13和CD14表达增高,同时FCM对细胞周期动力学的检测结果进一步地佐证诱导分化剂阻止细胞进入S期,使增殖抑制,出现细胞分化,并用Western Blot 方法 检测到PBK/TOPK基因表达的下调和PhoPBK/TOPK表达的少量增加.
TPA诱导HL60细胞向粒系或者单核细胞定向分化的机制极为复杂,尚不清楚是哪个或哪些基因在这一过程中发挥着关键性作用. 既往研究发现,HL60分化通常和细胞表面的受体表达改变有关,而正是这些受体调节着细胞分化. Beltran等[5]实验得出,阿片样肽受体(MOPR)很可能在激活蛋白(AP1)和转录因子(NFκB)联合介导下表达增加,促进HL60细胞分化成熟. 受维甲酸调控的新基因JWA在TPA诱导的HL60细胞分化中也起重要作用,并且和Bcl2表达呈负相关[6],另外,肿瘤抑制基因P27通过抑制细胞周期蛋白激酶的活动和自身的异位表达也参与细胞的增殖和分化[7]. 近来我们又发现PBK/TOPK在TPA诱导的HL60分化中发挥作用. 该基因编码322个氨基酸的丝/苏氨酸激酶,它由激酶的亚结构域和1个碳末端的锌指结构结合域组成,被认为和肿瘤抑制因子hDig相互作用. 它是MAPKK家族新的成员,系统进化树显示它是MEK1/2和MKK7之间的分支,更接近与MEK1/2,同源序列比对和MAPKK有很大的同源性. 部分研究表明,PBK/TOPK表达在增殖活性较高的恶性肿瘤中,尤其是血液系统的恶性肿瘤. 我们实验组同时证实PBK/TOPK蛋白表达在生发中心活化的B淋巴细胞中,是否在诱导不同白血病细胞系向不同方向分化时均伴有PBK/TOPK蛋白表达的下调,国内尚未见报道. 我们发现,TPA诱导HL60细胞向粒系、单核方向分化时,PBK/TOPK表达下调,这和国外 文献 报导一致[1],同时我们也发现细胞分化后PhoPBK/TOPK表达增强,说明细胞分化成熟的机制与细胞信号转导通路上的PBK/TOPK分子磷酸化有关,也提示TPA诱导HL60细胞向粒系或者单核细胞定向分化是个复杂的过程,很可能PBK/TOPK磷酸化后激活下游的MAPK分子致使HL60向成熟方向分化. 但具体激活哪条信号转导通路或者有哪些分子参与, 目前 尚不清楚,还有待进一步研究.
【 参考 文献】
[1] Nandi A, Tidwell M, Karp J, et al. Protein expression of PDZbinding kinase is upregulated in hematologic malignancies and strongly downregulated during terminal differentiation of HL60 leukemic cells[J]. Blood Cells Mol Dis, 2004,32(1):240-245.
[2] SimonsEvelyn M, BaileyDell K, Toretsky JA, et al. PBK/TOPK is a novel mitotic kinase which is upregulated in Burkitts lymphoma and other highly proliferative malignant cells[J]. Blood Cells Mol Dis, 2001,27(5):825-829.
[3] Sambrook J, Russell D. 分子克隆实验指南[M]. 3版. 北京: 科学 出版社,2002:1713-1726.
[4] Kim SH, Kang SN, Kim HJ, et al. Potentiation of 1, 25dihydroxyvitamin D(3)induced differentiation of human promyelocytic leukemia cells into monocytes by costunolide, a germacranolide sesquiterpene lactone[J]. Biochem Pharmacol, 2002,64(8):1233-1242.
[5] Beltran JA, Peek J, Chang SL. Expression and regulation of the mu opioid peptide receptor in TPAdifferentiation HL60 promyelocytic leukemia cells[J]. Int Immunopharmacol, 2006,6(8):1331-1340.
[6] 沈群,周建伟,盛瑞兰,等. JWA基因在HL60细胞定向分化中的表达及意义[J]. 中国 实验血液学杂志,2005,13(5):804-808.
[7] Cho S, Kim JH, Back SH, et al. Polypyrimidine tractbinding protein enhances the internal ribosomal entry sitedependent translation of p27Kip1 mRNA and modulates transition from G1 to S phase[J]. Mol Cell Biol, 2005,25(4):1283-1297.

 
 
 
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