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牙周膜肌成纤维细胞的体外培养及其标志物的表达时效
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【西药学类毕业论文】[摘要]目的 探讨人牙周膜肌成纤维细胞（MFB）体外培养及其标志物表达的时效性。方法 体外培养人牙周膜成纤维细胞（hPDLF），72 h内以5ug?L-1终质量浓度的转化生长因子（TGF）-B1诱导hPDLF向MFB转化，免疫细胞化学和免疫组织化学染色检测MFB标志物a-平滑肌肌动蛋白（a-S
[摘要]目的 探讨人牙周膜肌成纤维细胞（MFB）体外培养及其标志物表达的时效性。方法 体外培养人牙周膜成纤维细胞（hPDLF），72 h内以5ug?L-1终质量浓度的转化生长因子（TGF）-B1诱导hPDLF向MFB转化，免疫细胞化学和免疫组织化学染色检测MFB标志物a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）表达情况。分别进行12、24、48、72、96和120 h的MFB观察，采用流式细胞术观察MFB长时间培养的细胞活性，采用免疫细胞化学观察MFB长时间培养后的a-SMA表达情况。结果 经TGF-B1诱导后a-SMA呈阳性；诱导至120 h，a-SMA仍呈阳性，72 h内其表达稳定。结论 5 ug?L-1终质量浓度的TGF-B1成功诱导人牙周膜细胞向MFB转化。MFB体外培养具有时效性，培养0-72 h，其状态稳定。
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[关键词]人牙周膜成纤维细胞；肌成纤维细胞；a-平滑肌肌动蛋白
[中图分类号]Q 256 [文献标志码]A [doi]10.7518/gjkg.2015.03.010
本研究的前期体内试验证实，正畸牙牙周膜张力侧肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）可能参与了牙周膜改建和成骨细胞的成骨过程；但牙周膜内生物学环境复杂，在正畸生物力学的影响下，多种牙周膜细胞都可能出现类似于MFB标志物的表达情况；因此，要明确MFB在牙移动过程中可能发挥的作用，就需要进行体外试验，以明确MFB分泌细胞外基质及成骨的机制。MFB大多存在于组织处于外力环境时，而当外界张力因素去除掉后，MFB大多程序性死亡或退化消失。研究MFB的功能，在成功诱导出MFB后还需明确MFB的活性，即MFB可以维持多久，这样才能确定MFB的体外观察时间。
本试验采用转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-B1诱导人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblast，hPDLF）向MFB转化，从12 h起，分6个时间点对hPDLF进行最长120 h的观察。其中，以免疫荧光和免疫细胞化学观察MFB的诱导情况，以流式细胞术观察MFB长时间培养的细胞活性，以免疫细胞化学观察MFB长时间培养后的标志物a-平滑肌肌动蛋白（u-smooth muscle actin，u-SMA）的表达情况，旨在为后续研究MFB的功能奠定基础。
1.材料和方法
1.1材料
人牙周膜组织取自四川大学华西口腔医院因正畸或阻生而拔除的健康恒牙，患者年龄为12-28岁，患者知情同意。主要材料：高糖达尔贝科极限必需培养液（Dulbecco minimum essential medium，DMEM）、胎牛血清（Hyclone公司，美国），胰蛋白酶（Gibco公司，美国），鼠单抗角蛋白抗体（Dako公司，丹麦），鼠单抗波形蛋白抗体（Santa公司，美国），鼠单抗a-SMA（Abcam公司，英国），PV-9000试剂盒、二氨基联苯氨试剂盒、羊抗鼠四甲基罗丹明异硫氰酸酯（北京中杉公司），人重组TGF-B1（Protech公司，美国），4，6-二氨基-2-苯基吲哚（Invitrogen公司，英国）。
1.2方法
1.2.1人牙周膜成纤维细胞的培养 完整拔除牙体后刮取根中1/3的牙周膜组织，用探针均匀铺于无菌的25 mL培养瓶底，静置培养。从第7天开始，每3 d换液1次，4周后无细胞游出即为失败。以后每天在倒置相差显微镜下观察细胞贴壁和生长情况并照相记录。细胞贴壁后每隔3-5 d换液1次。当hPDLF生长形成单层，铺满瓶底时传代培养。取第4代hPDLF进行鉴定。
1.2.2人牙周膜MFB的诱导和鉴定 采取第5代hPDLF，按1×10个每毫升接种于六孔板中，行细胞爬片，培养24 h，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer solution，PBs）冲洗3次，换为无血清DMEM培养24 h，通过血清饥饿法快速获得大量G0或G1期细胞，然后加入含质量分数0.1%胎牛血清的DMEM和TGF-B1，使TGF-B1终质量浓度为5ug?L-1，诱导72 h后，再按12、24、48、72、96和120 h共6个时间点终止培养收样。采用免疫细胞化学和免疫荧光染色检测MFB标志物a-SMA的表达情况。
1.2.3流式细胞术检测MFB活性 以胰酶消化收集细胞。PBS冲洗3次，用体积分数70%的预冷乙醇悬浮固定细胞过夜，送检。上机检测前离心（离心半径6 cm，1 500 r?min-1×10 min）弃乙醇，PBS洗2次，加入磷酸枸橼酸缓冲液悬浮细胞，碘化丙锭1 g?L-1避光显色20 min，流式细胞仪在488 nm激发光检测其DNA质量，MCYCLE软件分析细胞周期和程序性细胞死亡率。
1.3阳性标准
细胞免疫化学染色：细胞形态完整，结构清晰，细胞着色水平明显高于背景水平，细胞质呈棕黄色，细胞核为蓝色。免疫组织化学染色：细胞骨架呈红色，细胞核呈亮蓝色。
1.4图像分析
采用尼康E600显微镜对细胞爬片进行观察，用SPOTCODCCD摄像头进行图像采集。用美国Image-pro plus 5.0图像分析系统软件进行统计学分析。
1.5统计学分析
全部数据均用均数±标准差（x±b）表示，统计学处理应用SPSS 13.0进行多因素方差分析，组间及组内均数间多重比较采用LSD及SNK法及两样本单因素方差分析并绘制图表。P<0.05为组间差异有统计学意义。
2.结果
2.1人牙周膜MFB的诱导和鉴定
经TGF-B1诱导后，人牙周膜MFB的诱导和鉴定结果见图1。
2.2a-SMA在MFB中不同时段的表达及各时段细胞细胞周期的分布情况 培养12 h，a-SMA在牙周膜MFB（图2A）明显表达；在24 h（图2B）、48（图2C）、72 h（图2D），大量棕黄染色的u-SMA高表达于MFB中，且染色强度无明显变化；至96 h（图2E），u-SMA表达量略有下降，但其差异没有统计学意义，细胞为细长型，细胞群呈束状排列；至120 h时（图2F），细胞在形态上无明显变化，a-SMA的表达量较96 h组有明显下降（P<0.001，图3A）。流式细胞术检测细胞周期随时间变化的情况显示，12、24、48、72 h，G0或G1期细胞所占比例为76%左右，经组间比较，差异无统计学意义；96 h组G0或G1期细胞所占比例为70.8%，与其他四组比较差异有统计学意义（图3B，表1）。
3.讨论
3.1MFB体外诱导方法及其鉴定
已有的研究证实，MFB受多种因素调节。虽然在生物力学作用下，诱导MFB的效果已被很多试验证实；但是，生物力学诱导MFB却存在诸多问题，例如，操作复杂，力学加载完后后续试验操作不易进行且加载机器缺乏一致性等。有试验证实，生物加载力去除3～6 h后，MFB会表现出程序性死亡或退化消失等现象；因此，在体外诱导MFB的试验中，以生物力学诱导MFB的方式多未被采用。目前，大多数研究多以TGF-B1诱导的手段获得MFB。这种诱导方式操作简便和准确，可重复性及可比性均较强；因此，本研究也采用TGF-B1诱导的方法以获得稳定的MFB。
TGF-B1具有多向调节作用，不同剂量，不同诱导时间对MFB的作用不尽相同。有研究指出：0.5ug?L-1的TGF-B1即可诱导成纤维细胞向MFB转化，出现a-SMA的表达；而且，随着TGF-B1质量浓度的增加，a-SMA的表达也随之上调，二者在TGF-B1小剂量时呈现一种剂量依赖效应；在TGF-B1的质量浓度超过5～10ug?L-1时，a-SMA的表达则无明显上升，亦不会受到明显抑制。Maninez等将5～10 ug-L-1作为TGF-B1的诱导质量浓度。不同的诱导时间对MFB的诱导结果也不尽相同，随着诱导时间的延长，a-SMA的表达成线性上升，72 h的诱导效果最好。本试验将TGF-B1的诱导质量浓度设定为5 ug?L-1，诱导时间设为72 h，结合a-SMA进行检测可以看到，诱导后免疫细胞化学和免疫组织化学染色的结果显示，细胞质a-SMA呈阳性，MFB的骨架结构清晰可见，a-SMA附着的张力纤维呈束状排列，所获得的MFB符合其一般表型。本研究结果说明，诱导时间72 h、质量浓度在5 ug-L-1的TGF-B1的诱导效果值得肯定。
3.2诱导过后MFB的活性和时效性
研究显示，MFB表达a-SMA不是一直稳定存在而是成阶段性出现。体内对创伤伤口愈合的研究发现，伤口出现的第1天，电镜下即可观察到细胞内出现微丝微管等结构；而到第3～4天，免疫组织化学染色即可见a-SMA呈强阳性，其后随着伤口愈合，MFB表达a-SMA又逐渐降低，至伤口愈合后5～10 d，MFB基本消失不见。通过TGF-B1诱导过后的MFB在诱导因素去除后仍可以维持较长的一段时间。有研究发现去除TGF-B1后，MFB至少可以再维持3～4 d。本研究结果亦证实了MFB的时效性，经过TGF-B1诱导的MFB，其持续时间在120 h时仍有较高的a-SMA表达。
本研究采用流式细胞术对MFB进行细胞分裂周期的检测，从而分析诱导过后的MFB活性。结果显示：在各时间点样本的G0或G1峰前并未出现明显的亚二倍体峰，说明并未出现明显的程序性细胞死亡；另外从MFB的培养情况看，到120 h时，细胞密度较12 h明显增大，但是a-SMA的表达却降低。本研究推测MFB在诱导剂去除后，退化为成纤维细胞而非程序性死亡的可能性较大。目前，很多研究均要求获得大量处于“基态”的细胞，即G0或G1期细胞用于研究。血清饥饿法正是一种可以快速获得大量G0或G1期细胞的方法。同时，血清饥饿法因其对细胞的干扰极小，从而广泛应用于各个研究中。研究显示，饥饿24 h后即可获得80%左右的G0或G1期细胞，而饥饿时间过长则会导致大量程序性细胞死亡。本研究亦在诱导前24 h进行无血清的DMEM培养饥饿成纤维细胞细胞，以获得大量G0或G1期细胞，随后采用含质量分数0.1%胎牛血清的DMEM诱导、培养细胞。流式细胞术检测结果显示，MFB在G0或G1期基本能维持在70%以上，而s期检测结果显示也比较稳定，说明MFB状态基本稳定，可以用于后续共培养模型的研究。
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