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欧盟草药药品质量标准中杂质检测相关要求
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【西医学论文】作者：汤依娜,邹文俊,张浩,刘忠荣,刘瑜【关键词】 欧盟；草药药品；质量标准；杂质检测2004年4月30日正式颁布的《欧盟传统草药药品注册指令》(Directive 2004/24/EC)[1]不仅明确定义了草药药品、传统草药药品等概念,而且正式承认了传统草药药品作为药品的法律地位,制订了相应的简化注册程序,并明确规定：根据传统应用的情况,可以免做该传统草药药品的临床试验或临床前研究,但并没有因此而降低对产品质量的要求,即欧盟对草药药品、传统草药药品质量控制的基本要求与药品完全一样。根据该指令新成立的欧盟药品审评局(European Medicine Agency, EMEA)下属的草药药品委员会(Committee of Herbal Medicinal Product, HMPC)已陆续制订出有关草药药品质量、安全性、有效性等一系列指南(Guidelines),在向多方征求意见、讨论后,部分指南已被HMPC采纳并生效。因此,欧盟对传统草药药品注册的要求日益细化、明确。中药作为世界传统草药的重要组成部分,从目前和长远来讲,熟悉并深入学习这些新的要求,尤其是对于开展注册相关理论和技术研究的有关政府机构、科研院所以及有意开拓欧盟市场的中药企业来讲都是非常有必要的。
鉴于药品质量对于传统草药药品注册的至关重要性,而且近年来药品中重金属、农药残留(简称“农残”)等不良杂质问题已经引起世界范围内的高度重视,本文将以由HMPC最新制订,并于2006年10月1日生效的2个与质量相关的重要指南——《草药药品/传统草药药品质量指南》(Guideline On Quality Of Herbal Medicinal Products/Traditional Herbal Medicinal Products)[2]和《质量规范指南：药材、草药加工品及草药药品/传统草药药品的检验方法和可接受标准》(Guideline On Specifications：Test Procedures And Acceptance Criteria For Herbal Substances, Herbal Preparations And Herbal Medicinal Products/Traditional Herbal Medicinal Products,以下简称《质量规范指南》)[3],以及涉及到的《欧洲药典》(5.0版)相关标准为依据,重点介绍欧盟对于草药药品和传统草药药品在杂质方面的具体规定与要求,力求为解决中成药质量标准有关杂质问题的研究提供一定的参考。
1 相关定义
按照2004年新颁布的《欧盟传统草药药品注册指令》中
相关定义,“药材(herbal substances)”仅指植物来源的药材。“草药加工品(herbal preparations)”主要是指各种植物药材提取物。“草药药品(herbal medicinal products)”是指一种或多种药材或者草药加工品作为活性成分的药品,与国内通常所称“中成药”、“中药制剂”相类似。欧盟所谓“传统草药药品(traditional herbal medicinal products)”是指在符合草药药品定义的基础上,还必须满足有特定适应症、不需在医生指导下使用,只能是口服、外用和/或吸入制剂,符合规定的传统应用期限等条件的产品[1]。欧盟对“传统草药药品”、“草药药品”的质量管理规定完全相同。
按照上述欧盟《质量规范指南》中有关规定,“杂质(impurities)”是药材、草药加工品、草药药品质量标准中“检查”项下内容之一,其定义为：“一是,药材中任何不符合其规定的物质或成分,二是,草药加工品/草药药品及其辅料中任何不符合其规定的物质或成分。”按照杂质来源,可分为2类：①来源于起始原料(包括活性物质和辅料)和所接触容器的杂质；②来源于相关生产过程的杂质。按照杂质性质,可分为3类：①污染物,包括重金属及砷化物、农残、真菌毒素、熏蒸剂、微生物污染、外源(extraneous sources)杂质,以及某些特殊情况下可能存在的放射性物质；②降解产物,因草药药品性质特殊而降解产生的有毒物质或成分；③残留溶剂,主要来源于生产过程。欧盟对药材、草药加工品和草药药品在重金属及砷化物、农残、真菌毒素、熏蒸剂、微生物污染和残留溶剂等杂质方面的规定基本相似,如,都要求有适宜的检验方法,制订相应的限量,并充分说明制订的理由。一般来讲,对于重金属及砷化物、农残、真菌毒素、熏蒸剂、残留溶剂,如果已在药材和草药加工品的质量标准中进行了控制,在草药药品中则不必重复检验。而微生物污染方面,草药药品则必须按规定进行检验。以下将分别介绍欧盟对于重金属及砷化物、农残、真菌毒素、熏蒸剂、微生物污染和残留溶剂6种杂质的相关规定和要求。
2 杂质检测方法及限量
2.1 重金属及砷化物
2.1.1 检测方法
《质量规范指南》指出应按照《欧洲药典》的方法来测定药材、草药加工品和草药药品的重金属及砷化物。《欧洲药典》中重金属检测方法有2种,一是采用比色法,检测以铅为代表的在规定实验条件下能与硫代乙酰胺或硫化钠作用显色的金属杂质总量[4]；二是采用原子吸收光谱法,定量测定铅、镉、汞、铜、锌、镍、铁的含量[5]。砷的检测方法也分为标准砷斑比色法[6]和原子吸收光谱法2种[5]。
2.1.2 限量规定
《欧洲药典》中仅有极少数品种有重金属限量规定,如海带：镉≤4 ppm,铅≤5 ppm,汞≤0.1 ppm；亚麻籽油：镉≤0.5 ppm；氢化花生油：镍≤1 ppm。其他品种一般均未标明通用的重金属限量。事实上,对于多数草药药品而言,目前欧盟主要遵循的是食品中重金属限量规定,例如,铅：0.02～1.0 ppm,镉：0.05～1.0 ppm,汞：0.5～1.0 ppm[7]。德国草药标准一向以严格著称,也具有较好的参考价值。德国卫生部(BMG)规定药材中铅、镉、汞的通用上限含量分别为5.0 ppm、0.2 ppm、0.1 ppm[8]。关于砷的限量规定,《欧洲药典》中除规定海带的砷限量为90 ppm外,尚无砷含量的通用标准,但德国医药厂商协会(BAH)则建议将砷通用限量定为5 ppm。
2.2 农药残留
《质量规范指南》指出,必须全面考虑到农药残留的可能性。根据《欧洲药典》的定义,农药是指用于预防、杀死或控制任何妨碍药材生产、加工、储藏、运输、销售的害虫或其他有害动植物的一种物质或者几种物质的混合物。农药也包括生长调节剂、落叶剂、除草剂,以及为了防止在储藏和运输中变质,而在农作物收获前后施用的物质。
2.2.1 检测方法
《欧洲药典》中分别规定了有机氯、有机磷、拟除虫菊酯类农药的提取、纯化方法和检测方法。供试品提取采用丙酮、甲苯溶剂法,提取物纯化一般采用体积排阻色谱和硅胶色谱法,定量测定采用气相色谱内标法。
2.2.2 限量规定
《欧洲药典》列出了包括艾氏剂、六六六、DDT及其异构体在内的42种农药限量(见表1),对于药典中未列出的农药,需另外参照欧盟76/895指令和90/642指令的相关限量规定。对于上述2个指令中也未提及的农药,其限量可由药典中所列公式计算[9]。需引起注意的是,德国对食品和草药中农残限量的规定,主要遵循《最大残留限度法令》(German Maximum Residue Levels Ordinance,德文简写RhmV)[10],其对于相关农药成分限量值与《欧洲药典》的规定却是有差异的。
2.3 真菌毒素
真菌毒素(mycotoxins)是指曲霉、青霉、镰刀霉等丝状真菌产生的具有生物毒性的次级代谢产物,如黄曲霉毒素(aflatoxin)、赭曲毒素(ochratoxin)、展青霉素(patulin)。人和动物摄入含有真菌毒素的谷物或食品后,将发生严重的真菌毒素中毒症。例如,《欧洲药典》和《质量规范指南》中专门提及的黄曲霉毒素,分为B1、B2、G1、G2等10多种,尤其以黄曲霉毒素B1为强致癌物质。表2 欧盟食品中真菌毒素的限量规定及标准来源（略）注：“-”表示未列该项。表1 《欧洲药典》中农药残留限量的规定（略）
2.3.1 检测方法
目前,《欧洲药典》中尚未列出真菌毒素的检验方法和具体限量,但在药材总论中指出,必要时应对黄曲霉毒素的限量做出规定[11]。在实际中,药材、草药加工品和草药药品可参照欧盟食品中真菌毒素的相关要求执行。一方面,由于真菌毒素在食品中的分布通常很不均匀,待测样本量、取样方法对结果影响很大,因此在欧盟相关食品法规[12]中,对不同种类食品的取样、试样制备方法作了详尽的规定；另一方面,欧盟食品法规中也并未规定必须采用薄层色谱法、微柱筛选法、酶联吸附免疫法、免疫亲和柱-荧光法、免疫亲和柱-HPLC法等何种具体方法来测定真菌毒素,检测实验室可自行选择适宜的方法,但必须满足方法学上空白对照、回收率、标准偏差、精密度、重现性等方法学考查指标的规定。
2.3.2 限量规定
欧盟食品中真菌毒素的限量及标准来源参见表2[13-15]。值得注意的是,《德国食品黄曲霉毒素污染标准》不仅适用于食品,也适用于草药。因此,对中成药目前申请欧盟传统草药药品注册中制订真菌毒素的标准具有一定参考价值。
2.4 熏蒸剂
熏蒸剂(Fumigants)主要是指可杀灭害虫和虫卵,防止害虫破坏储藏的药材所使用的化学物质,如,甲基溴、磷化氢、氯化苦等,但各种化学熏蒸剂都存在着不同程度的人畜毒性和环境污染。自1989年12月31日以来,欧洲已经禁止使用环氧乙烷熏蒸药材[11]。甲基溴是欧盟目前使用最广泛的熏蒸剂,但由于甲基溴会造成臭氧层的破坏,根据1992年制订的《蒙特利尔议定书》哥本哈根修正案,目前已逐步被淘汰。
《欧洲药典》中尚无熏蒸剂检测方法和限量的规定。HMPC 2006年10月发表了对于熏蒸剂使用的考虑意见[16],目前还不具备法律效力。HMPC建议,尽可能地限制使用熏蒸剂,除非根据实际情况必需时才使用。使用时应注意熏蒸剂的选择和施用的时间长短,并对熏蒸剂毒性及其对生态环境、药材本身的影响进行风险评价。应尽量减小对施药操作人员和消费者的健康危害。对于残留的熏蒸剂还应建立适宜的分析方法、限量。
2.5 微生物
欧盟对药材、草药加工品和草药药品的微生物检验要求是有所区别的。对于药材和草药加工品,微生物指标未作为必须检验指标,但若有必要,其检验方法则须采用《欧洲药典》检验方法[17-18],其微生物限量可参考《欧洲药典》药物制剂的微生物限量相关规定[19]。而对于草药药品而言,则必须遵循《欧洲药典》的微生物检验方法和限量规定。
2.5.1 检验方法
微生物检验包括需氧微生物总数、酵母菌和霉菌总数以及控制菌数(沙门氏菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等)的检验。需氧微生物总数、酵母菌和霉菌总数可采用薄膜过滤法、平板计数法,或者最大可能数计数法(most- probable-number method,MPN法)测定。控制菌的检验需采用选择性培养基培养规定检查的菌株,并进行菌株验证。
2.5.2 限量规定
《欧洲药典》中的制剂分为4类：第1类为无菌制剂；第2类包括局部用制剂、呼吸道制剂(无菌呼吸道制剂除外)和透皮贴剂；第3类分为A和B两个小类：A类为口服和直肠给药制剂；B类为含有天然来源的动植物或矿物质的制剂(但不包括第4类草药药品),B类制剂虽无法进行抗菌预处理,但允许原料的需氧微生物总数超过每克或每毫升5×103个；第4类为由一种或多种完整的、部分完整或打粉的药材组成的制剂,按照使用前是否需加入沸水,再分为A(使用前需加入沸水)和B(使用前不需加入沸水)两个小类。根据传统草药药品给药方式的限制,第3和第4类制剂的微生物限量参见表3。表3 《欧洲药典》第3和第4类制剂的微生物限量规定（略）注：“-”表示未列该项。
2.6 降解产物
《质量规范指南》指出,如果草药药品含有源于药材或其提取物的降解产物(如由羟基蒽苷降解得到的苷元),则需对降解产物进行检测,并制订其可接受的限量。此外,草药药品中如果含有维生素和矿物质,则应控制维生素和矿物质的降解产物,但如果能用实际的数据、适宜的分析方法,表明在具体的组成和特定贮藏条件下,维生素和矿物质不会降解,经批准后,对降解产物的检测可以简化或免做。
2.6.1 检测方法
降解产物的分析检测方法、报告限度、鉴定限度、质控限度需参照欧盟《新药杂质指南》[20]。事实上,该指南并非主要针对草药产品的降解产物,而是针对化学原料药的降解产物、原料药与辅料反应的产物、原料药与直接接触的容器反应的产物。同时,草药药品中含有的维生素、矿物质仍然适用于该指南。由此可以看出,欧盟对草药药品的质量标准仍然借鉴了一部分化学药的标准,并没有放松对产品质量安全性的考虑。根据降解产物性质的不同,可采用化学法、光谱法、色谱法等方法进行检测。
2.6.2 限量规定
根据药物最大日服用量的不同,欧盟药品中降解产物的报告限度、鉴定限度、质控限度规定不同。报告限度(reporting threshold)：超出此限度的降解产物均应在检测报告中报告,并应报告具体的检测数据。鉴定限度(identification threshold)：超出此限度的降解产物均应进行定性分析,确定其化学结构。质控限度(qualification threshold)：质量标准中一般允许的降解产物限度,如制订的限度高于此限度,则应有充分的依据。如果降解产物的毒性较大,应制订其更低的报告限度、鉴定限度、质控限度。参见表4。表4 欧盟药品降解产物限度（略）注：*为报告限度,△为鉴定限度,▲质控限度；“TDI”表示降解产物的每日总摄入量。
2.7 残留溶剂
残留溶剂是指草药加工品和草药药品生产过程中,未完全除去的挥发性有机溶剂。根据溶剂毒性的高低,《欧洲药典》中将溶剂分为4类：第1类为应避免使用的致癌性溶剂；第2类为限制使用的有一定毒性的溶剂；第3类为药品GMP或其他质量要求限制使用的有潜在低毒性的溶剂,如乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸、乙酸乙酯等,第3类溶剂的每日允许安全摄入量(permitted daily exposure,PDE,PDE值大,该溶剂的安全性更高)不得低于50 mg；第4类为尚无足够毒理学资料的溶剂。草药加工品和草药药品生产过程中,如果已对草药加工品进行了适宜的残留溶剂控制,则不需在草药药品中重复检测。但如果是包衣等制剂成型过程中用了其他溶剂,仍需控制该溶剂的残留。
2.7.1 检测方法
第1、2类溶剂(残留限量高于0.1%时)的定量测定需参照《欧洲药典》残留溶剂的通则[21]。由于第3类溶剂在生产工艺中使用非常广泛,用量也很大,其残留问题值得重视。如果只使用了第3类溶剂,可按照干燥失重不超过0.5%的限度控制溶剂残留量,残留限量高于0.5%时要求定性鉴别,并采用气相色谱法定量测定[21-22]。《欧洲药典》采用A、B双色谱系统的静态顶空进样气相色谱法检测残留溶剂,优先采用A系统,B系统通常仅作为检测结果的进一步确认,并附有第1类和第2类溶剂分别在A、B色谱系统条件下的典型色谱图。
2.7.2 限量规定
苯、四氯化碳等第1类溶剂和乙腈、氯仿等第2类溶剂的浓度限量可参见《欧洲药典》。第1类溶剂的浓度限量多在10 ppm以内,第2类溶剂的PDE值一般接近0.1 mg/d,不同溶剂的浓度限量从50 ppm到3 880 ppm不等。未列出第3类溶剂的浓度限量[23]。
3 小结
欧盟高度重视草药药品以及传统草药药品的质量安全性,从上述重金属和砷化物、农药残留、真菌毒素、熏蒸剂、微生物、残留溶剂等杂质方面的要求可以看出,对于这些方面的检验方法和限量规定已经比较清晰和具体。我国中成药申请欧盟传统草药药品注册,在制订杂质方面的质量标准时,应尽量采用《欧洲药典》等规定的法定方法,并符合《欧洲药典》或相关欧盟法规对于杂质的限量要求,同时,还需密切关注欧盟草药药品委员会陆续发布的各种相关的质量指南,如,欧盟已经着手制订专门针对药品的真菌毒素相关规定,草案可能将于2007年公布,以及欧盟可能将在已公布的熏蒸剂使用考虑意见的基础上,出台正式的相关法规。深入了解并努力达到欧盟对于杂质方面的要求,将十分有助于中成药作为欧盟传统草药药品注册成功。
致谢：感谢中国中医科学院中药研究所王智民教授对本文的亲力指导,以及成都地奥制药集团药物研究所青琳森、魏琪同志的支持和帮助。
【参考文献】
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