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正己烷致大鼠脂质过氧化及肝细胞DNA损伤的实验研究其它医学
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【中药专业毕业论文】 作者：齐宝宁，易建华，唐国慧，苗江丽，郭剑锋【摘要】 目的 研究 正己烷(nhexane)对大鼠的脂质过氧化作用和肝细胞DNA损伤的 影响 。 方法 40只雄性SD大鼠随机分成5组，即阴性对照组、75、150、300mg/kg染毒组和阳性对照组，每组8只。经腹腔注射染毒4周后，检测肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)的活力，血清还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)的含量；用彗星试验技术(SCGE)检测大鼠肝细胞DNA的损伤。 结果 大鼠体重随染毒时间而增加，阴性对照组增加最快；随染毒剂量增加，肝组织匀浆中SOD、GSHPx活力、血清GSH含量明显降低，而血清MDA含量增大，组间比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)；肝细胞SCGE检测彗星尾长、尾DNA(%)、尾矩、Olive尾矩均增大，组间比较有显著性差异(P<0.01)，尾矩值与染毒剂量作相关 分析 ，相关系数r为0.981，呈正相关(P<0.05)。 结论 正己烷可引起或增强机体氧自由基反应，导致脂质过氧化损伤和肝细胞DNA损伤。
【关键词】 正己烷；脂质过氧化；DNA损伤；单细胞凝胶电泳技术
正己烷(nhexane，CAS:110543)属于直链饱和脂肪烃类，化学式为C6H14，分子式为CH3(CH2)4CH3，分子量86.18；无色、高挥发性、易燃、常温下为微有异臭的液体；几乎不溶于水，易溶于氯仿、乙醚、乙醇[12]。正己烷主要作为溶剂，广泛 应用 于制鞋、印刷、 电子 、粘胶配制、除污、干洗、植物油提取等行业[3]。有 文献 表明[45]：正己烷对神经细胞脂质有极化作用，导致膜扩张，通透性增强。动物吸入正己烷后，血中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、葡萄糖6磷酸脱氢酶、酸性脱氢酶、β尿苷酸化酶活性增高。这些内酶的外逸，间接说明正己烷具有膜损伤作用。沈齐英等[6]对大鼠静式急性吸入染毒，测定了MDA、GSH、SOD和GSHPx等体现脂质过氧化损伤的特异性指标。结果表明，正己烷的急性吸入导致机体氧化还原系统的变化，削弱了机体消除自由基的能力，发生了脂质过氧化损伤。正己烷引起机体氧化还原系统的改变，导致自由基水平升高，是否会进一步引起DNA损伤， 目前 尚未见有报道。故本实验用不同剂量的正己烷染毒大鼠，对其脂质过氧化和DNA损伤进行检测。旨在观察正己烷对大鼠的脂质过氧化及DNA损伤的影响，为探讨正己烷的遗传毒性和中毒机制提供 理论 依据和实验数据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
健康雄性SpragueDawley(SD)大鼠40只，体重180-220g，由西安 交通 大学医学院实验动物中心提供，适应性喂养一周后进行染毒实验。
1.1.2 试剂
正己烷(国产分析纯)，环磷酰胺(上海华联制药有限公司)，Triton X100(Gibco公司，美国)，戊巴比妥钠、低熔点琼脂糖(low melting agarose gel, LMA)、正常熔点琼脂糖(normal melting agarose gel, NMA)、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)、乙二胺四乙酸二钠盐(Na2ethylenediamine, Na2EDTA)、溴化乙锭(ethidium bromide, EB)均为美国Sigma公司产品。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSHPx)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和还原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone, GSH)测试盒均为南京建成生物工程研究所产品。
1.1.3 仪器
DYYⅢ水平电泳槽 ，DYY Ⅲ33A电泳仪 ，NIKON荧光显微镜型及NIKON AFXⅡA型拍摄装置 ，恒温水浴箱，DY89Ⅱ型电动玻璃组织匀浆器，CASP图像分析软件。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及染毒
将40只雄性SD大鼠随机分为5组，即阴性对照组、低剂量染毒组、中剂量染毒组、高剂量染毒组和阳性对照组(环磷酰胺)，每组8只，采用腹腔注射染毒[5]。阴性对照组仅用注射针穿刺腹腔，不注射任何试剂，低、中、高暴露组染毒剂量分别为75、150、300mg/kg，阳性对照组为50mg/kg，每日上午染毒1次，每周5d，连续4周。染毒过程中，所有大鼠均自由饮水、进食。每3d称体重1次，调整染毒剂量，记录大鼠的一般状况和体重变化。
1.2.2 单细胞凝胶电泳试验
参照Singh等[7]方法略加改进。主要步骤有：①单细胞悬液的制备。染毒结束后，用质量浓度为20g/L(2%)的戊巴比妥钠麻醉大鼠，剖开腹部，立即取出一5nm×5nm肝脏组织，装于盛有4℃磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)的小烧杯中，洗去血液，然后加入RPMI 1640培养液，用眼科剪剪碎，制成单细胞悬液。② 胶板的制备。将预热50℃ 100μL质量分数为0.6%的NMA滴加到无水乙醇浸泡的磨砂载玻片上，迅速盖上干净的盖玻片，室温下静置10min使其凝固，为第1层凝胶；取10μL大鼠肝细胞悬液加入37℃ 80μL质量分数为0.5%的LMA中，混匀后迅速滴加到第1层胶上，立即盖上干净的载玻片，室温下静置10min使其凝固，为第2层胶；最后在第2层胶上滴加预热37℃的质量分数为0.5%的LMA,盖上盖玻片，室温下使其凝固。③细胞裂解。移去盖玻片，将载玻片浸入新配制的细胞裂解液(2.5mol/L NaCl，100nmol/L Na2EDTA，10nmol/L Tris，10g/L肌氨酸钠，临用前加体积分数为1%的TritonX100，10% DMSO，pH＝10)中，于4℃冰箱中裂解1h。④碱解旋。从裂解液中取出载玻片，用PBS冲洗2次，洗去过多的盐，晾干后置于水平电泳槽中，将新配制的电泳缓冲液(1mmol/L Na2EDTA，300mmol/L NaOH，pH=13，4℃预冷)倒入电泳槽中，液面约覆过胶面0.25cm左右，避光静置25min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋成单链DNA，使DNA断片在电泳场中易于迁移。⑤电泳。电压为25V，电流300mA，4℃环境下电泳20min。⑥中和与染色。电泳结束后，取出载玻片，吸水纸吸干电泳缓冲液，用0.4mol/L的TrisHCl(pH＝7.5)中和15min，然后每片载玻片上滴加30mg/L的EB水溶液50μL，盖上盖玻片，染色20min，即可观察。⑦阅片。24h内在荧光显微镜下观察，数码相机拍摄照片，每张玻片随机拍摄30个细胞，在电脑上用CASP彗星软件分析。
1.2.3 血清脂质过氧化指标的测定
染毒结束后，用质量浓度为20g/L(2%)的戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹部开U型口，暴露心脏，从心尖抽取5mL全血，置于试管中，37℃水浴2h，离心(3000r/min，10min)，分离血清检测GSH和MDA含量。MDA含量测定按硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)比色法，GSH含量测定按Haffeman微量法。
1.2.4 组织匀浆抗氧化酶活力测定
立即取新鲜肝脏组织块(0.2-1g)，除去血液，滤纸拭干，称重，加入9倍重量的冷生理盐水，用组织匀浆机制成10%匀浆液，检测SOD和GSHPx活力。SOD活力测定按邻苯三酚自氧化法，GSHPx活力测定按二硫代二硝基苯甲酸(dithiobisnitrobenzoic acid, DTNB)直接法。
1.3 统计学处理
测定值以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS11.5软件对数据进行 分析 ，多组均数之间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两组之间的多重比较分别采用Dunnettt检验和SNKq检验。
2 结 果
2.1 大鼠体重的变化
实验期间，各组体重均随时间而增加，对照组体重增加最快，低剂量组与对照组比较无明显差异。在0、3、6、12、21、28d时分别作方差分析，从第6天开始，组间有显著性差异(P<0.05)；各实验组与阴性对照组作Dunnettt检验，中、高剂量组与对照组之间有显著性差异(P<0.05或P<0.01)；各实验组之间再作SNKq检验，低剂量组和高剂量组有显著性差异(P<0.05，表1)。表1 各剂量组大鼠在不同时间的体重变化（略）
2.2 正己烷对大鼠血清MDA和GSH含量的 影响
血清中MDA含量随染毒剂量增加而增大，GSH含量则随染毒剂量增加而减少，作方差分析，组间有显著性差异(P<0.05)；各实验组与阴性对照组作Dunnettt检验，中、高剂量组与对照组之间有显著性差异(P<0.05或P<0.01)；实验组之间再做SNKq检验，低剂量组和高剂量组有显著性差异(P<0.05，表2)。表2 各组大鼠血清中MDA、GSH含量的变化（略）
2.3 正己烷对大鼠肝组织匀浆SOD和GSHPx活力的影响
肝组织匀浆中GSHPx 、SOD活力随染毒剂量增加而减小，作方差分析，组间有显著性差异(P<0.05)；各实验组与阴性对照组做Dunnettt检验，高剂量组与对照组之间有显著性差异(P<0.01)；实验组之间再作SNKq检验，低剂量组和高剂量组有显著性差异(P<0.05，表3)。
表3 各剂量组大鼠肝组织匀浆SOD、GSHPx的活力（略）
2.4 正己烷对大鼠肝细胞DNA损伤的影响
随着染毒剂量的增加，尾长、尾DNA(%)、尾矩、Olive尾矩值均增大。各实验组与对照组做Dunnettt检验。结果显示，阳性对照组与阴性对照组比较，尾长、尾DNA(%)、尾矩、Olive尾矩均有显著性差异(P<0.01)；中、高剂量组与阴性对照组比较，尾长、尾DNA(%)、尾矩、Olive尾矩有显著性差异(P<0.01)；低剂量组与阴性对照组比较，无显著性差异。实验组之间再做SNKq检验，低剂量组和高剂量组有显著性差异(P<0.05，表4)。
2.5 大鼠肝细胞SCGE结果的相关分析
以染毒剂量为横坐标，尾矩值为纵坐标做散点图，观察随正己烷染毒剂量的增加对大鼠肝细胞DNA损伤的剂量效应关系。做相关分析，相关系数r为0.981，呈正相关(P<0.05)。表4 各组大鼠肝细胞单细胞凝胶电泳的结果（略）
3 讨 论
机体代谢及损伤过程中可产生超氧自由基，若不及时消除，就会对自身造成氧化胁迫，引起脂质过氧化，对细胞膜甚至整个细胞造成损伤。但在正常的生理条件下机体同时存在抗氧化系统，能清除自由基，阻断脂质过氧化，保护细胞的正常生理功能，这是需氧生物抵御过氧化损伤的主要机制[8]。SOD和GSHPx是体内两种十分重要的抗氧化酶，是机体抗氧化防御系统的重要成员。GSH是细胞中最重要的非酶性小分子抗氧化剂之一。 MDA是自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸而引发的脂质过氧化作用的最终分解产物，其含量水平可反映机体内细胞脂质过氧化的程度。本次实验通过正己烷对大鼠亚急性染毒，观察正己烷对大鼠脂质过氧化的作用。通过检测大鼠的肝脏组织匀浆中SOD、GSHPx酶的活性和血清中GSH和MDA含量来反映脂质过氧化程度。结果表明，各正己烷染毒组与对照组相比较，抗氧化酶SOD和GSHPx活性降低，GSH含量减少，MDA含量增加，组间比较有显著性差异(P<0.05)，且随着染毒剂量的增加，呈现一定的剂量效应关系。这与 文献 [6]报道一致，进一步证实了正己烷的脂质过氧化作用。检测DNA损伤的 方法 有很多，如中性或碱性蔗糖密度梯度离心法、DNA碱解旋法、中性或碱性滤膜洗脱法等[9]。但这些方法不能对单个细胞进行分析，需要放射性标记，而且设备和技术条件要求较高。本次实验中采用Singh等建立和改进的单细胞凝胶电泳技术(single cell gel electrophoresis, SCGE)又称彗星试验(comet assay)检测单个细胞DNA损伤。该方法具有灵敏、简便、快速及样品用量少、不需放射性等优点，广泛 应用 于放射生物学、DNA损伤与修复，DNA交联、内源性自由基攻击所致的DNA氧化性损伤、遗传毒 理学 、肿瘤 治疗 评价及细胞凋亡等领域的 研究 [10]。本次实验应用单细胞凝胶电泳技术检测了肝脏细胞DNA损伤情况，并用彗星图像分析软件CASP对图像进行分析。结果显示，正己烷能使大鼠肝细胞DNA产生链断裂损伤，并且随着染毒剂量的增加，彗星尾长及尾部面积越来越大，DNA损伤程度越严重，呈现出剂量效应关系。脂质过氧化过程是一个产生自由基和自由基参与的链式反应。其中产生的多种自由基和非自由基产物可引起细胞功能障碍，特别是具有中等反应活性的脂自由基L·，LO·和LOO·，易穿透并扩散进入细胞核，与碱基起加合反应，直接攻击DNA或RNA；自由基对DNA的损伤可以是活性氧直接作用于核酸，引起碱基的修饰和DNA链的断裂[11]，也可以是间接通过脂质过氧化作用和糖氧化作用产生新的羰基对DNA的修饰[12]。本实验结果表明，正己烷对大鼠肝细胞DNA的损伤可能与其对肝细胞膜损伤引起脂质过氧化作用，削弱机体消除自由基的能力有关。具体损伤机制及其相关关系还需进一步的研究。
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