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当前位置:教育论文中心首页--博士论文--乳酸克鲁维酵母糖基工程研究
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乳酸克鲁维酵母糖基工程研究
 
     论文目录
 
摘要第1-9页
Abstract第9-12页
前言第12-20页
 (一) 乳酸克鲁维酵母表达系统第12-13页
 (二) 酵母和哺乳动物细胞N-糖基化修饰途径第13-16页
 (三) 酵母糖基人源化研究进展及意义第16-19页
 (四) 本研究的目的第19-20页
第一部分 乳酸克鲁维酵母URA3 营养缺陷型菌株的构建第20-28页
   ·实验材料第20-22页
     ·菌株、质粒和细胞第20页
     ·工具酶、抗体及分子量标准第20页
     ·主要试剂及试剂盒第20-21页
     ·主要仪器及配件第21页
     ·主要培养基和溶液第21-22页
   ·实验方法第22-25页
     ·K. lactis URA3 基因敲除载体的构建第22-24页
     ·K. lactis URA3 基因的敲除第24-25页
   ·结果第25-28页
     ·用于敲除K. lactis URA3 基因载体的构建及其鉴定第26页
     ·K. lactis URA3 基因的敲除及其鉴定第26-28页
第二部分 乳酸克鲁维酵母低糖化表达系统的建立 — OCH1、MNN1 基因的敲除第28-54页
   ·实验材料第28-32页
     ·菌株、质粒和细胞第28-29页
     ·工具酶、抗体及分子量标准第29页
     ·主要试剂及试剂盒第29页
     ·主要仪器及配件第29-30页
     ·主要培养基第30页
     ·主要溶液第30-32页
   ·实验方法第32-42页
     ·K. lactis OCH1 基因敲除菌(Kloch1Δ)的构建第32-33页
     ·K. lactis OCH1 基因的敲除及其鉴定第33页
     ·K. lactis MNN1 基因敲除菌(Kloch1Δ、mnn1Δ)的构建第33-35页
     ·K. lactis MNN1 基因的敲除及其鉴定第35页
     ·HSA/GM-CSF 表达载体的构建第35-36页
     ·HSA/GM-CSF 在乳酸克鲁维酵母野生型和缺陷型菌株中的表达第36-39页
     ·HSA/GM-CSF 融合蛋白N-糖链的FACE 分析第39页
     ·HSA/GM-CSF 融合蛋白N-糖链的DSA-FACE 分析第39-42页
   ·结果第42-54页
     ·用于敲除K. lactis OCH1 或MNN1 基因载体的构建及其鉴定第42页
     ·K. lactis OCH1 基因的敲除及其鉴定第42-43页
     ·K. lactis MNN1 基因的敲除及其鉴定第43页
     ·HSA/GM-CSF 基因的获得第43-44页
     ·pKLAC1/HSA/GM-CSF 表达载体的构建第44-45页
     ·HSA/GM-CSF 在乳酸克鲁维酵母中的表达及纯化第45-49页
     ·HSA/GM-CSF 融合蛋白N-糖基分析第49-54页
第三部分 α-1,2-甘露糖苷酶I 在K. lactis KLGE03 菌株内的定位和高效表达第54-74页
   ·实验材料第55页
     ·植株、菌株和质粒第55页
     ·工具酶、抗体及分子量标准第55页
     ·主要试剂、主要仪器及配件第55页
   ·实验方法第55-63页
     ·α-1,2-甘露糖苷酶I(MANI)基因的获得第55-58页
     ·MANI 基因定位信号的钓取第58-59页
     ·MANI 表达载体的构建第59-61页
     ·乳酸克鲁维酵母KLGE03(HSA/GM-CSF)的转化第61-62页
     ·pYES2/och1-LAC4-Signal-MANI 酵母转化子的鉴定第62页
     ·K. lactis KLGE03-GM-MANI 转化子诱导表达及报告蛋白的纯化第62页
     ·HSA/GM-CSF 融合蛋白N-糖链的FACE 分析第62页
     ·HSA/GM-CSF 融合蛋白N-糖链的DSA-FACE 分析第62-63页
   ·结果第63-74页
     ·α-1,2-甘露糖苷酶I(MANI)基因的获得第63-64页
     ·定位信号的获得第64-65页
     ·强启动子LAC4 的获得第65页
     ·MANI 表达载体的构建及其鉴定第65-69页
     ·MANI 的表达及报告蛋白HSA/GM-CSF 的纯化第69-70页
     ·MANI 活性鉴定第70-72页
     ·小结第72-74页
结论第74-75页
讨论第75-80页
 1. Man_5GlcNAc_2 结构的获得为K. lactis 人源化糖基改造提供了重要基础第75-77页
 2. KlOCH1 和KlMNN1 的双敲除提供了一种新型的低糖化表达系统第77页
 3. 两步基因重组技术提供了高效、可重复利用筛选标记来敲除敲入目的基因的方法第77-78页
 4. N-糖链分析技术是酵母糖基工程高通量和快速筛选的基础第78-80页
附录第80-83页
 1. 主要引物设计序列表第80-81页
 2. 菌株基因型表第81-82页
 3. 缩略词表第82-83页
参考文献第83-90页
致谢第90页

 
 
论文编号BS1560721,这篇论文共90
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