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萘乙酸对K562细胞和正常人外周血淋巴细胞遗传物质损伤效应的比较其它医学
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【中医学评职论文】 作者：倪磊，宋土生，廉姜芳，王爱英，刘丽英，黄辰【摘要】 目的 比较萘乙酸(naphthalene acetic acid, NAA)对K562细胞和正常人外周血淋巴细胞染色体损伤效应的差异。 方法 常规方法制备姐妹染色单体互换(SCE)和微核，检测NAA对K562细胞与正常人外周血淋巴细胞SCE、微核形成率以及细胞分裂指数的 影响 。结果 NAA可诱导K562细胞和人正常淋巴细胞微核形成和提高SCE频率，与对照组相比均存在显著性差异；NAA诱导K562细胞微核形成率和SCE频率绝对增长值高于正常淋巴细胞组。NAA显著抑制K562细胞和人正常淋巴细胞分裂指数，绝对抑制率也表现为K562细胞高于正常淋巴细胞。结论 NAA具有诱导细胞染色体损伤的作用。
【关键词】 萘乙酸；K562细胞；淋巴细胞；SCE；微核
萘乙酸(naphthalene acetic acid, NAA)作为植物生长激素，广泛 应用 于植物的组织培养以及无土栽培等植物种植业中。现已证明萘对人体具有明显的毒副作用，可以引起染色体畸变[1]。一些萘的衍生物，如萘胺，可引起职业性膀胱癌；而另一些萘的衍生物，可以用于临床 治疗 ，如萘芬被用于治疗皮肤病[2]。本 研究 组证明萘乙酸可以抑制K562细胞的增殖[3]，但是萘乙酸是否可以成为肿瘤治疗的药物，尚需要对其进行遗传毒理的 分析 。本文应用NAA处理正常人外周血淋巴细胞以及白血病K562细胞，研究其对遗传物质的作用。
1 材料与方法
1.1 材料 NAA(化学纯，97.0%)，购自 中国 医药集团上海化学试剂公司，K562细胞购自上海细胞所，健康个体肝素抗凝外周血采自西安 交通 大学医学院。
1.2 方法
1.2.1 实验分组 K562细胞和健康个体外周血淋巴细胞均分为空白对照组、NAA 50μmol/L组和NAA 100μmol/L组。每组设3个平行实验组。K562细胞浓度为5×104/mL，在37℃、5% (体积分数)CO2下培养到实验时间。健康个体外周血作微量全血培养。
1.2.2 微核实验 在37℃、5%(体积分数)CO2下培养72h后，离心收获细胞，用低渗液处理细胞10min。离心后，用新鲜配制的甲醇/冰醋酸(3∶1)固定细胞，制片，Giemsa染色20min，镜检，以1000个细胞为一组 计算 微核的千分率。微核的识别：在完整的淋巴细胞浆内与主核分离，直径小于主核的1/3，结构和染色与主核相同[2]。
1.2.3 SCE实验 在37℃、5%(体积分数)CO2下培养48h，加入Brdu，使其终质量浓度为10mg/L，继续培养。在培养终止前4h加入秋水仙素，于72h收集细胞，制片，UV照射30min，水洗，Giemsa法染色，观察完整并明显分染的中期相细胞，以50个细胞为一组，求得每个细胞的互换率[3]。
1.2.4 分裂指数 统计1000个细胞中分裂细胞的数目。
1.3 统计学处理 各实验处理组与对照组测得的数据以±s表示，应用SPSS医学统计软件作t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 NAA对K562细胞和健康个体淋巴细胞微核形成的影响 NAA可以诱导正常淋巴细胞微核形成，与对照组相比差异存在统计学意义(P<0.05)。但在50和100μmol/L NAA处理组间差异无统计学意义(P>0.05)。NAA也可诱导K562细胞微核形成，但与对照相比无显著性差异，而绝对数值的增加高于正常淋巴细胞(表1)。
表1 NAA对人正常淋巴细胞和K562细胞微核形成率的影响（略）
Table 1 The effect of NAA on the frequency of micronucleus formation of k562 cell and normal lymphocytes
*P<0.05, **P<0.01 vs. control group
2.2 NAA对K562细胞和健康个体淋巴细胞姐妹染色单体互换(SCE)频率的影响 与对照相比，NAA可以提高人正常淋巴细胞和K562细胞SCE频率，差异存在显著性(P<0.01)。而在50和100μmol/L NAA处理组间差异均无显著性(P>0.05)。NAA对K562细胞SCE作用的绝对数值高于相应的对照组(表2)。
表2 NAA对人正常淋巴细胞和K562细胞SCE频率的影响（略）
Table 2 The effect of NAA on the sister chromatid exchange frequency of k562 cells and normal lymphocytes
*P<0.01 vs. control group
2.3 NAA对K562细胞和健康个体淋巴细胞细胞分裂指数的 影响 NAA对K562细胞和健康个体淋巴细胞细胞分裂指数均有抑制作用，但抑制效果存在差异。在NAA 50μmol/L浓度时，NAA抑制正常淋巴细胞分裂的抑制率为24.98%，差异无显著性；而对K562细胞的抑制率达40.25%，差异存在显著性(P<0.05)。在NAA 100μmol/L浓度时，NAA对正常淋巴细胞和K562细胞细胞分裂抑制率分别达到49.96%和44.97%。NAA对K562细胞分裂的绝对抑制率高于正常淋巴细胞(表3)。
表3 NAA对人正常淋巴细胞和K562细胞分裂指数的影响（略）
Table 3 The effect of NAA on the sister cell division index of k562 cells and normal lymphocytes
*P<0.05, **P<0.01 vs. control group
3 讨论
萘乙酸是一类芳香烃类化合物，作为植物激素在植物生长调节中得到广泛的 应用 。在植物组织培养中，NAA浓度一般在50-100μmol/L之间。萘乙酸在植物中的残留，是否能引起动物遗传物质发生变异，尚无相关 研究 报道。评估NAA对动物的毒性作用，可以为植物激素安全使用提供 理论 依据。
研究证明萘乙酸可以通过阻滞细胞周期而抑制K562细胞的增殖，同时可以诱导凋亡的发生[3]。细胞周期阻滞与细胞分化或染色体损伤相关。萘乙酸可以诱导肿瘤细胞K562以及正常淋巴细胞微核形成，以及增加SCE频率。由于肿瘤细胞染色体存在不稳定性，因此，对照组K562细胞的微核形成率和SCE频率均显著高于正常淋巴细胞组(P<0.01)，而且NAA诱导微核形成率以及SCE频率的绝对增长值高于正常淋巴细胞相应处理组，表明NAA对肿瘤细胞作用较强。在处理的第3天，50μmol/L NAA处理组正常淋巴细胞分裂指数与对照相比无显著差别(P>0.05)，而K562细胞分裂指数与相应对照组存在显著性差异(P<0.05)，抑制率可达40.25%，提示NAA具有抑制K562增殖的作用。
大量研究表明萘的毒性是通过诱导细胞自由基的产生而引起[5]。动物实验表明对萘的耐受能力与P53的活性相关[6]。NAA诱导正常淋巴以及K562细胞染色体损伤是否也是通过诱导自由基产生，有待证明。
【 参考 文献 】
[1]Willems BA, Melnick RL, Kohn MC, et al. A physiologically based pharmacokinetic model for inhalation and intravenous administration of naphthalene in rats and mice [J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2001,176(2):8191.
[2]Greer DL, Weiss J, Rodriguez DA, et al. A randomized trial to assess oncedaily topical treatment of tinea corporis with butenafine, a new antifungal agent [J]. Am Acad Dermatol, 1997, 37:231235.
[3]倪磊,黄辰,宋土生，等. 萘乙酸抑制K562细胞增殖作用的初步研究 [J]. 西安 交通 大学学报(医学版), 2005,26(4):309311.
[4]封少龙，孔志明，王五香，等. 吡虫啉和抑食肼对人体外周血淋巴细胞遗传物质的影响 [J]. 癌变·畸变·突变, 2002, 14(4):210213.
[5]Bagchi M, Bagchi D, Balmoori J, et al. Naphthaleneinduced oxidative stress and DNA damage in cultured macrophage J774A.1 cells [J]. Free Radic Biol Med, 1998, 25(2):137143.
[6]Bagchi D, Balmoori J, Bagchi M, et al. Role of p53 tumor suppressor gene in the toxicity of TCDD, endrin, naphthalene, and chromium (vi) in liver and brain tissues of mice [J]. Free Radic Biol Med, 2000, 28(6):895903.
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