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健脾活血方对2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠骨骼肌葡萄糖转运蛋白-4 基
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【西药学毕业论文】【摘要】 目的探讨健脾活血方对2型糖尿病胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)大鼠葡萄糖转运蛋白-4(Glucose Transporter-4,GLUT-4)mRNA表达的的改善作用及机理。方法取Wistar大鼠60只，采用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)加高脂饮食造成2型糖尿病IR大鼠模型，设空白组
【摘要】 目的探讨健脾活血方对2型糖尿病胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)大鼠葡萄糖转运蛋白-4(Glucose Transporter-4,GLUT-4)mRNA表达的的改善作用及机理。方法取Wistar大鼠60只，采用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)加高脂饮食造成2型糖尿病IR大鼠模型，设空白组、模型组、健脾活血方低剂量组、健脾活血方高剂量组和罗格列酮组，以RT-PCR法检测大鼠骨骼肌GLUT-4 mRNA的表达。结果健脾活血方高剂量组大鼠骨骼肌GLUT-4 mRNA的表达与罗格列酮组相当，与模型组比较有显著性差异(P<0.01)。结论健脾活血方能够上调大鼠骨骼肌GLUT-4 mRNA的表达，改善IR。
【关键词】 健脾活血方; 2型糖尿病大鼠; 葡萄糖转运蛋白
Abstract：ObjectiveTo explore the effect and mechanisms of Trengthening Spleen and Activating Blood Prescription on expressions of GLUT-4 gene in the skeletal muscle tissue of Type 2 Diabetes Mellitus rats.Methods60 Wistar rats were randomized into five groups:normal control group,model group, Strengthening Spleen and Activating Blood Prescription low-dose group and high-dose group, Rosiglitazone group. The model of Type 2 Diabetes Mellitus IR was established by adopting STZ and high-fat diet, GLUT-4 gene expression in skeletal muscle tissue was detected by RT-PCK.ResultsThe expression of GLUT-4 gene in Strengthening Spleen and Activating Blood Prescription high-dose group was the same with Rosiglitazone groups,and there was significant difference compared to model group(P<0.01).ConclusionStrengthening Spleen and Activating Blood Prescription can up-regulate the expression of GLUT-4 gene in Type 2 Diabetic rats,and improve insulin resistance.
Key words：Trengthening Spleen and Activating Blood Prescription; Type 2 Diabetes Mellitus Rats; GLUT-4; Experimental Research
目前普遍认为，IR和Ins分泌缺陷是2型糖尿病的发病基础，其中IR是贯穿于2型糖尿病发生、发展的全过程的重要因素，IR被认为是基因与环境间相互作用的结果。在众多候选基因中，GLUT-4与2型糖尿病胰岛素抵抗的发生关系密切[1]。本实验以健脾活血方治疗2型糖尿病IR模型大鼠，观察其对2型糖尿病IR大鼠GLUT-4 mRNA表达的改善作用并探讨其机理。
1 材料
1.1 动物Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重220～240 g，清洁级，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
1.2 药物健脾活血方由人参、黄芪、三七、丹参、生地等组成。饮片购自哈尔滨世一堂制药厂。将以上中药按配方煎成200%的药液(即每毫升药液含2 g原生药材煎出物)，冷却后密封，4℃保存备用;罗格列酮：太极涪陵制药有限公司。批号0511020。临用前将罗格列酮用蒸馏水配制成混悬液。
1.3 试剂抗胰岛素受体β亚单位抗体和抗β-actin抗体：博士德公司;RT-PCR试剂盒：美国 Promega公司;上、下游引物来源于美国生物信息中心(NCBI)，引物设计使用Primer5.0软件，上海捷倍思基因技术公司合成;胰岛素放射免疫分析药盒(FR-FJ-021)：北京市福瑞生物工程公司;STZ:Sigma公司;β-actin (长度540 bp) 5-GTCACCCACACTGTGCCCATC-3;骨骼肌 GLUT-4上游引物(长度350 bp)5-GACGCCGTTGGGGCTACAAA-3;骨骼肌 GLUT-4下游引物(长度350 bp)5-AGAGGAAGTT TCAGCCCCTC -3。
1.4 仪器数字凝胶成像系统Chemi Imager4000(Algpha Innotech Corporation)：美国安来公司 ;DU640核酸分析仪：美国生产;电泳凝胶图象分析系统 ：Backman公司;血糖仪及试纸：美国强生公司。
2 方法
2.1 动物分组与处理造模参照文献方法[2]加以改造，将60只 Wistar大鼠给予基础饲料及自来水适应性喂养1周。第2周，将大鼠随机分为2组。空白组12只给予基础饲料，饮用自来水;造模组48只喂高脂饲料,饮用自来水。两组鼠分别喂养8周。第10周开始，造模组按体重25 mg/kg一次性腹腔注射0.25% STZ(溶于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲溶液，pH4.4);空白组腹腔注射等体积0.lmmol/L、pH4.4枸椽酸盐缓冲液。禁食12 h。对造模组大鼠断尾采血，挑选空腹血糖≥11.1 mmol/L的大鼠，除空白组12只鼠，共有40只造模组大鼠进入实验，根据体重随机分为4组，即模型组、健脾活血方高剂量组、健脾活血方低剂量组、罗格列酮组。空白组大鼠和模型组大鼠灌喂给予蒸馏水;高剂量组和低剂量组给予健脾活血方,分别为16 g/kg和8 g/kg，罗格列酮组按0.20g/kg的剂量灌喂罗格列酮混悬液，连续给药2周后，处死大鼠，提取骨骼肌，与低温冰箱(MDF-U50V型)中保存备用。整个实验过程中模型组大鼠死亡2只，中药低剂量组大鼠死亡1只。
2.2 检测指标及方法 2.2.1 空腹血糖(FBG)测定给药前及给药2周后，大鼠禁食12 h，断尾采血。用血糖仪测定血糖。 2.2.2 空腹胰岛素(Fins)测定给药前及给药2周后，大鼠禁食12 h，眼眶静脉丛取血5 ml，用LG-10A离心机37
2.2 检测指标及方法
2.2.1 空腹血糖(FBG)测定给药前及给药2周后，大鼠禁食12 h，断尾采血。用血糖仪测定血糖。
2.2.2 空腹胰岛素(Fins)测定给药前及给药2周后，大鼠禁食12 h，眼眶静脉丛取血5 ml，用LG-10A离心机37℃恒温离心(2 500 r/min,10min)15 min，取血清，采用放射免疫双抗体法测定。
2.2.3 RT-PCR法检测骨骼肌 GLUT-4 mRNA的表达 提取骨骼肌总RNA。实验步骤：①骨骼肌组织匀浆：于冰上进行。取100mg骨骼肌组织，放入玻璃匀浆器中，加入Trizol 试剂1 ml研磨。 ②25℃水浴箱中孵育5 min。③将匀浆产物移入1.5 ml离心管中，加入氯仿0.2 ml，混摇15 s，室温放置5 min。④4℃离心(12 000 r/min)15 min。⑤将上层无色液体移入1.5 ml离心管中，加入0.5 ml异丙醇，室温放置10 min后混匀。⑥4℃离心(12 000 r/min)15 min。⑦去上清液。加入75%乙醇1ml，4℃离心(7 500 r/min)5 min。重复该步骤2次。⑧放置10 min。⑨用水溶解后计算所提RNA量，使A260/A280比值保持在1.8以上。-70℃低温冰箱保存。
RNA逆转录。实验步骤：①取上述标本RNA2 μg，加入总量20 μl下述混合液体：5×缓冲液4.0 μl;10 mmol/L dNTP2.0 μl;逆转录酶0.5 μl;上、下游引物各0.5 μl;25 mmol/L MgSO41.5 μl;RNA2.0 μg;加入去Rnase的蒸馏水9.5 μl。②12 000 r/min，离心约1 min。③42℃水浴箱中孵育45 min合成cDNA。④95℃水浴箱中10 min灭活逆转录酶。
DNA聚合酶链反应(PCR)。实验步骤：①每个PCR扩增管中加总量25 μl下述混合液：模板cDNA1.0 μl;5×缓冲液5.0 μl;10 mmol/L dNTP2.0 μl;Taq酶1.0 μl;上、下游引物各0.5 μl;加入双蒸水15.5 μl。②振荡，略离心上述混合液。③PCR扩增仪扩增。反应条件：变性,94℃ 30 s;退火,60℃ 60 s;延伸,70℃ 60 s。共做36个循环后，72℃延伸5 min。
RT-PCR产物分析(光密度扫描法)。取10 μl PCR扩增产物10 μl以1.5%琼脂糖凝胶，100 V电压电泳60 min，GoldView染料染色，在紫外灯下观察结果、拍照。采用Kodak2.0软件对PCR产物琼脂糖凝胶电泳进行扫描分析及数据处理。
2.3 统计方法数值以±s表示，用STATA 7.0软件计算。P﹤0.01，P﹤0.05为差异具有显著性。
3 结果
3.1 对大鼠FBG，Fins，胰岛素敏感性指数(ISI)的影响结果显示，造模后，大鼠FBG，Fins显著升高，ISI显著下降，与空白组相比，有显著性差异(P<0.01)，说明造模成功。给药后，各组大鼠血糖下降，其中以罗格列酮组疗效最显著，与模型组比，有显著性差异(P<0.01);健脾活血方高剂量组与模型组比有明显差异(P<0.05)，但其降血糖作用不及罗格列酮。经治疗后，各组大鼠Fins均下降，ISI提高，其中以中药高剂量组和罗格列酮组改善最为显著，与模型组比有显著性差异(P<0.01)，中药高剂量组与罗格列酮组比较无统计学意义。结果见表1～3。表1 对大鼠FBG的影响与模型组比较，﹡﹡P<0.01，﹡P<0.05表2 对大鼠Fins的影响表3 对大鼠ISI的影响
3.2 对大鼠骨骼肌GLUT-4 mRNA 表达的影响RT-PCR产物在琼脂糖电泳凝胶紫外灯下均可见：各组β-actin电泳条带亮度一致，扩增片段均为300bp。骨骼肌GLUT-4 mRNA的500bp片段，但各组电泳条带亮度有明显差异，模型组大鼠骨骼肌GLUT-4 mRNA的表达减弱，与空白组大鼠比较有显著性差异(P<0.01);各治疗组大鼠骨骼肌GLUT-4 mRNA的表达增强，以罗格列酮组和健脾活血方高剂量组的改善最为明显，与模型组比较有显著性差异(P<0.01);健脾活血方高剂量组与罗格列酮组比较无统计学意义。图1～2和表4。表4 对大鼠骨骼肌中GLUT-4/β-actin mRNART-PCR电泳产物灰度扫描比值的影响与模型组比较，﹡﹡P<0.01，﹡P<0.05
4 讨论
GLUT-4是一种分子量为45～55 kD，含509个氨基酸单一多肽链的糖蛋白，具有12个跨膜螺旋片段。GLUT-4存在于胰岛素敏感的骨骼肌、心肌和脂肪细胞中。在没有胰岛素刺激时主要位于细胞内的贮存囊泡内。当胰岛素与受体结合后，激发一系列级联效应，导致富含GLUT-4的囊泡向细胞外膜移动，囊泡膜与细胞外膜融合，GLUT-4转位至细胞外膜且活性增加，与葡萄糖结合并发生结构改变，将葡萄糖转运至细胞内后恢复原来结构。当循环胰岛素水平下降时，GLUT-4通过吞饮作用从细胞外膜清除并回到贮存囊泡中。由此胰岛素敏感组织可迅速对循环胰岛素水平作出反应，保持血糖平衡[4]。近年研究发现，2型糖尿病患者骨骼肌GLUT-4囊泡的亚细胞分布及转位异常，即GLUT-4主要分布于高密度膜部分，且在胰岛素刺激下向细胞外膜的转位减少[5]。Zierath等[6]研究发现，骨骼肌细胞长期暴露于高浓度胰岛素中导致GLUT-4活性降低或转位障碍，且对生理浓度的胰岛素刺激无反应。骨骼肌是全身葡萄糖利用的最主要组织，也是胰岛素介导葡萄糖进入细胞内的重要部位，约占全部葡萄糖转运的90%(脂肪组织只占5%左右)。本研究通过以高脂饮食加STZ复制2型糖尿病IR大鼠模型，以健脾活血方进行干预，并以罗格列酮作对照，结果表明，模型组大鼠GLUT-4 的转位受到影响，骨骼肌GLUT-4 mRNA的表达减少，对胰岛素的敏感性和反应性降低;健脾活血方组大鼠和罗格列酮组大鼠骨骼肌GLUT-4 mRNA的表达增加，与模型组比较有显著性差异(P<0.01)，二组大鼠对胰岛素的敏感性提高。提示健脾活血方对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗具有改善作用，且存在一定的量效关系，其机制可能是健脾活血方增加了大鼠骨骼肌GLUT-4 mRNA的表达和﹑或促使大鼠骨骼肌GLUT-4 mRNA的跨膜转运，此问题有待于进一步探讨。
【参考文献】
[1] Maureen J,Charron S,Ellen B，et al.GLUT4 gene ragulation and manipulation[J]. J Bio Chemistry，1999，274(6):3253.
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[6] Zierath J R, Krook A, Wallberg-HenrikssonH. Insulin action in skeletal muscle from patients with NIDDM[J].Mol Cell Biochem,1998,182:153.
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