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表达猪端粒酶反转录酶转座子载体的构建及其在猪细胞永生化中的应用

论文目录

摘要	第2-4页
Abstract	第4-5页
符号说明	第9-10页
综述一：端粒酶介导的细胞永生化研究进展	第10-21页
1 猪成纤维细胞的分离培养	第10-13页
1.1 猪成纤维细胞的特点	第10-11页
1.2 猪成纤维细胞的培养方法	第11-12页
1.3 纯化方法	第12-13页
2 端粒酶介导的细胞永生化研究进展	第13-18页
2.1 端粒	第14页
2.2 端粒酶	第14-17页
2.2.1 端粒酶RNA	第15页
2.2.2 端粒酶相关蛋白	第15-16页
2.2.3 端粒酶逆转录酶	第16-17页
2.3 端粒与细胞衰老、永生化的关系	第17-18页
2.5 细胞永生化的意义	第18页
参考文献	第18-21页
综述二：SB转座子作为基因转移载体的研究进展	第21-27页
1. SB转座子的结构	第21-22页
2. SB转座机制	第22-23页
3. SB转座子作为基因转移载体的优势	第23-24页
4. SB转座子的应用与展望	第24-25页
参考文献	第25-27页
研究内容一：表达猪端粒酶反转录酶转座子载体的构建及鉴定	第27-45页
摘要	第27页
1 材料	第27-28页
1.1 主要试剂、质粒、细胞和菌株	第27-28页
1.2 主要试剂配制	第28页
1.3 主要仪器	第28页
2 实验方法	第28-37页
2.1 细胞基因组的提取	第28-29页
2.2 细胞RNA提取	第29-30页
2.3 反转录反应	第30-31页
2.4 报告载体构建	第31-35页
2.4.1 PCR扩增目的基因	第31-33页
2.4.2 PCR产物测序	第33页
2.4.3 目的片段与载体连接	第33-35页
2.5 猪EF-1a启动子的转录活性检测	第35-36页
2.6 转座子介导报告基因整合检测	第36页
2.7 猪TERT转座子载体的构建	第36-37页
2.7.1 cDNA的RT-PCR扩增	第36-37页
2.7.2 载体与目的片段连接	第37页
3 结果	第37-42页
3.1 报告载体的构建	第37-39页
3.1.1 PCR扩增目的片段	第37-39页
3.1.2 载体的酶切鉴定	第39页
3.2 细胞基因转染与荧光显微镜观察	第39-40页
3.3 转座子介导的报告基因整合效率检测	第40-41页
3.4 转座子载体的构建与鉴定	第41-42页
3.4.1 猪TERT eDNA扩增与测序鉴定	第41-42页
4 讨论与小结	第42-44页
参考文献	第44-45页
研究内容二：表达猪端粒酶反转录酶转座子在猪源细胞永生化中的应用	第45-65页
摘要	第45页
1 材料	第45-47页
1.1 实验动物、细胞与毒株	第45页
1.2 主要试剂、质粒和菌株	第45-46页
1.3 主要试剂配制	第46页
1.4 主要仪器	第46-47页
2 方法	第47-54页
2.1 猪肾成纤维细胞分离培养	第47-48页
2.1.1 猪肾的分离	第47页
2.1.2 猪肾成纤维细胞分离	第47-48页
2.2 细胞转染与阳性克隆筛选	第48-49页
2.2.1 无内毒素质粒提取	第48-49页
2.2.2 细胞转染(方法同2.5)	第49页
2.2.3 筛选及阳性克隆获得	第49页
2.3 转染细胞生长特性测定	第49-54页
2.3.1 生长曲线和群体倍增时间	第49-50页
2.3.2 克隆形成效率	第50页
2.3.3 FACS检测细胞生长周期	第50-51页
2.3.4 细胞形态学观察	第51页
2.3.5 RT-PCR检测细胞标志与TERT表达	第51页
2.3.6 ELISA检测猪端粒逆转录酶活性	第51-52页
2.3.7 细胞病毒易感性	第52-53页
2.3.8 致瘤性检测	第53页
2.3.9 支原体污染检测	第53-54页
3 结果	第54-62页
3.1 猪肾成纤维细胞形态特征	第54页
3.2 阳性克隆的获得	第54-55页
3.3 转染细胞生长特性	第55-62页
3.3.1 细胞生长曲线、群体倍增时间及克隆形成率	第55-56页
3.3.2 FACS检测细胞生长周期	第56-57页
3.3.3 细胞形态观察	第57-58页
3.3.4 细胞标志检测	第58-59页
3.3.5 端粒酶及其活性检测	第59-60页
3.3.6 肿瘤形成力检测	第60页
3.3.7 细胞病毒易感性	第60-61页
3.3.8 细胞支原体检测	第61-62页
4 讨论与小结	第62-63页
参考文献	第63-65页
附录	第65-69页
致谢	第69-70页

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