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大孔吸附树脂分离纯化长春花中长春碱和长春新碱
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【主管药师论文】作者：潘岳峰,王慧敏,张玥,韩静,张立军,殷莉梅,杨静【摘要】 目的 优选分离纯化长春花中长春碱和长春新碱的最佳工艺参数。方法 采用不同型号大孔吸附树脂对长春花中长春碱和长春新碱分离纯化,用不同浓度乙醇水溶液以不同速度洗脱,配合硅胶柱层析,以HPLC跟踪检测。结果 AB-8型树脂分离效果佳,90%乙醇水溶液以1.5 BV/h的速度洗脱,总比吸附量达到74.5 mg/g,经硅胶柱层析后长春新碱纯度达97.26%,长春碱纯度达94.18%。结论 该工艺简便合理,重复性良好,能得到高纯度的长春碱和长春新碱。
【关键词】 大孔吸附树脂；长春花；长春新碱；长春碱
Abstract：Objective To optimize the technological parameters of separation and purification of vinblastine and vincristine from Gatharanthus Roseus. Methods Different types of macroporous adsorption resin were used to separate and purify vinblastine and vincristine from Gatharanthus Roseus, eluting with different concentration of alcohol aqueous and velocities, combined with silica gel column chromatography, the process was monitored by HPLC. Results AB-8 type resin showed better comprehensive adsorption property, 90% alcohol aqueous and 1.5 BV/h velocities were used to elute. Ratio adsorption quantity was achieved to 74.5 mg/g. Through silica gel column chromatography, the purity of vincristine was achieved to 97.26% and the purity of vinblastine was achieved to 94.18%. Conclusions The process is simple and reasonable with good reproducibility. It is effective to enrich highly purified vinblastine and vincristine.
Key words：macroporous adsorption resin；Gatharanthus Roseus；vinblastine；vincristine
长春花为夹竹桃科长春花属中一种重要的药用植物,迄今已经分离出70余种生物碱,其中以长春新碱(Vincristine)和长春碱(Vinblastine)最具价值。长春新碱通过作用于肿瘤细胞微管蛋白而干扰肿瘤细胞代谢,临床主要用于治疗急性淋巴细胞白血病、何杰金及非何杰金淋巴瘤,也用于乳腺癌、支气管肺癌、软组织肉瘤及神经母细胞瘤等。
对于长春碱和长春新碱的分离纯化工艺,国内外已有相关介绍,Gunaselcera Sarath P[1]、Atta-ur-Rahman[2]、Jean-Hugues Renault[3]等人分别采用不同方法纯化长春碱和长春新碱,但大都烦琐、耗时、耗费有机溶剂,造成环境污染,且成本高,不利于工业化生产。
由于大孔吸附树脂广泛应用于天然植物活性成分(皂苷、黄酮、生物碱等)的提取分离[4-6],经该技术处理后可使有效成分高度富集,且可有效除去大量糖类、无机盐等成分, 降低产品吸潮性,提高产品质量。因此,本试验主要通过此技术对长春花中长春新碱和长春碱的分离纯化工艺进行研究,并配合硅胶柱层析,得到较高纯度的长春碱和长春新碱。
1 仪器与试药
长春花提取液(自制,含总碱17.95 mg/mL,沈阳药科大学生物化工实验室鉴定)；长春花(海南省)；长春新碱和长春碱标准品(广东岭南制药有限公司提供)。甲醇(山东市禹王实业有限公司化工分公司),磷酸(沈阳经济技术开发区试剂厂),二乙胺(天津市博迪化工有限公司),乙醇(天津市百世化工有限公司),超纯水(杭州娃哈哈集团有限公司),硅胶(青岛海洋化工厂分厂)。大孔树脂：D101(天津市瑞金特化学品有限公司),D102(天津南开大学化工厂),AB-8(天津南开大学化工厂),D-3520(天津南开大学化工厂),HPD-100(河北沧州宝恩化工有限公司)。
JY92-2D型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司),高效液相色谱仪(日本日立公司),DF-101S型恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司),SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司),ALC-210.3型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司),800B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。
2 方法与结果
2.1 高效液相色谱分析
色谱条件：采用Diamonsi1TM C18色谱柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm,迪马公司)；流动相为甲醇-水-二乙胺(700∶295∶5),磷酸调pH＝7；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min；紫外检测波长为297 nm；进样量为20 μL。
长春新碱标准曲线方程为：A＝3×107C－12 292(r＝0.999 5),线性范围2.0～20.0 μg/mL；长春碱标准曲线方程为：A＝2×107C－78 105(r＝0.999 6),线性范围5.0～30.0 μg/mL。
2.2 长春碱和长春新碱分离纯化工艺的优选
2.2.1 长春花提取液的制备
以长春花全草为原料,提取长春总碱主要采用超声法,最佳工艺为：90%甲醇水溶液作溶剂、浸泡时间为16 h、超声温度为40 ℃、功率为600 W、超声30 min。长春新碱和长春碱的提取率可达到90.14%和79.26%。
由于药液浓度直接影响树脂的吸附效果,根据Langmuir单分子层理论[7],树脂的吸附量与药液的浓度在一定范围内成正比,因此,根据预试验,选择最佳药液浓度为17.95 mg/mL,其中长春新碱8.11 mg/mL,长春碱6.12 mg/mL。
2.2.2 树脂的筛选
选择大孔吸附树脂分离有效成分时利用其吸附的可逆性[8-10]。根据“相似相溶”原理,脂溶性成分如生物碱等应选用非极性或弱极性树脂,因此,预选D101、D102、AB-8、D-3520、HPD-100共5种树脂。
2.2.3 树脂的预处理
取以上树脂,分别在提取器内加入高于树脂层10 cm的80%乙醇,浸渍4 h后用80%乙醇淋洗,至流出液用一定量的水稀释不混浊,再用水反复洗涤至乙醇含量小于1%。用2 BV的5%HCl溶液,以4 BV/h的流速通过树脂层,并浸泡4 h后,用水洗至中性,再用2 BV的2%Na0H溶液,同法洗至中性备用。
2.2.4 静态吸附试验
精密称取预处理后树脂,每份含干燥树脂5.0 g,分别加入长春花提取液50 mL,在常温磁力搅拌下吸附12 h,过滤,测定不同树脂滤液中长春碱和长春新碱的含量。将各过滤后树脂中加入70%乙醇50 mL,放置12 h,过滤得解析液,同法测定含量。计算树脂对长春碱和长春新碱的吸附能力,公式：A吸＝C1V1－C2V2/W,其中A吸为树脂比吸附量(mg/g), C1为提取液有效成分含量(mg/mL),V1为提取液体积(mL),C2为滤液有效成分含量(mg/mL),V2为滤液体积(mL),W为树脂质量(g)。A解＝C3V3/WA吸,其中A解为树脂解吸率(%),C3为解析液中有效成分含量(mg/mL),V3为解析液体积(mL)。结果见表1。以优选AB-8型树脂为最佳。表1 不同树脂的静态吸附能力（略）
2.2.5 动态吸附试验
精密称取预处理后树脂AB-8(含干燥树脂5.0 g),湿法装入2.1 cm×40 cm的柱子中,不断加入长春花提取液,吸附流速为2 BV/h,每试管收集5 mL流出液。HPLC测定长春碱和长春新碱的含量,结果见图1。
由图1可知,当流出液体积为100 mL时长春碱的泄漏量开始增大,流出液体积为125 mL时长春新碱的泄漏量显著增大,根据公式P吸＝(C前－C后)V吸/W,其中P吸为树脂比吸附量(mg/g), C前为吸附前提取液有效成分含量(mg/mL),C后为吸附后溶液有效成分含量(mg/mL),V吸为吸附溶液体积(mL),W为树脂质量(g),确定树脂最佳比上柱量为68.36 mg/g。
2.2.6 洗脱中乙醇浓度的考察
精密称取预处理后树脂AB-8(含干燥树脂5.0 g),取长春花提取液50 mL,吸附流速为2 BV/h,分别选择80%、85%、90%、95%,100%乙醇洗脱,洗脱流速为1.5 BV/h,收集洗脱液,HPLC检测,并计算洗脱能力：E＝C洗V洗/W,其中E为比洗脱量(mg/g),C洗为洗脱液中有效成分含量(mg/mL),V洗为洗脱液体积(mL),W为树脂质量(g)。结果见图2。
由图2可知,随着乙醇浓度逐渐增大,长春新碱的比洗脱量也不断上升,90%时达到最大；乙醇浓度在85%和90%时长春碱的比洗脱量较高且基本持平,因此,考虑成本及误差,选择90%乙醇溶液作为长春碱和长春新碱的洗脱剂。
2.2.7 洗脱流速的考察
精密称取预处理后树脂AB-8(含干燥树脂5.0 g),取长春花提取液50 mL,吸附流速为2 BV/h,以90%乙醇洗脱,洗脱流速分别为0.5、1、1.5、2、2.5 BV/h,HPLC检测,计算树脂洗脱能力,以洗脱流速1.5 BV/h最佳。见图3。
2.2.8 洗脱液中酸液浓度的考察
保持其他条件不变,选择不同浓度的硫酸溶液调节洗脱液pH值,HPLC检测,计算树脂洗脱能力(见图4)。可见,当酸液浓度为3%时,长春碱和长春新碱的洗脱效果达到最佳。
2.2.9 洗脱终点的考察
精密称取预处理后树脂AB-8(含干燥树脂5.0 g),取长春花提取液50 mL,吸附流速为2 BV/h,用90%乙醇溶液洗脱,调节酸液浓度为3%,洗脱流速为1.5 BV/h,收集洗脱液,HPLC检测(见图5)。可见,流出液体积为25～100 mL时,组分含量逐渐增加,大于100 mL时长春碱含量骤然降低,大于125 mL时长春新碱含量亦骤然降低,当流出液体积大于175 mL时,已经基本将组分洗脱完毕。
2.2.10 硅胶纯化工艺及结果
将大孔吸附树脂分离后的长春总碱(含量为76.4%)采用硅胶柱进一步纯化。优选二氯甲烷-甲醇＝20∶1作为长春碱的洗脱剂,15∶1作为长春新碱的洗脱剂,HPLC检测(见图6～图8),得长春碱纯度97.26%,收率61.12%；长春新碱纯度94.18%,收率58.50%。
3 讨论
采用静态吸附与解吸试验,从5种非极性或弱极性大孔吸附树脂中,筛选出适用于长春碱和长春新碱分离纯化的AB-8型树脂；通过动态吸附实验,以比吸附量、解吸率、比洗脱量为指标,确定最佳条件为：比上柱量68.36 mg/g,洗脱液浓度90%乙醇水溶液,洗脱流速1.5 BV/h,酸液浓度3%,洗脱终点175 mL。
洗脱液的选择应符合2个条件：其一,溶剂应能使大孔网状吸附剂溶胀,这样可减弱溶质和吸附剂之间的吸附力；其二,溶剂应容易溶解吸附物。因此,综合考虑选择乙醇水溶液作为溶剂。在弱碱性物质洗脱过程中,宜调节pH值,使溶剂呈酸性易于洗脱。
本试验改变传统分离纯化长春总碱的方法,首先采用成本低、易操作的大孔树脂分离,再通过硅胶柱层析,将吸附后含量为76.4%的总碱进一步纯化,得长春碱纯度97.26%,收率61.12%；长春新碱纯度94.18%,收率58.50%。该工艺收率高,避免使用有机溶剂,环保,适宜工业化生产。大孔吸附树脂每使用一次,比上柱量约下降4%,因此,大孔树脂再生问题有待进一步考察。
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