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苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系研究其它医学
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【中医学评职论文下载】【摘要】 目的 探讨苏云金芽孢杆菌(Bt)与蜡状芽孢杆菌(Bc)的亲缘关系,为Bt鉴定、安全性评价及降低其致病风险等提供 科学 依据。 方法 采用肠杆菌基因间重复一致序列-PCR(ERIC-PCR)技术,对6株苏云金芽孢杆菌和3株蜡状芽孢杆菌及对照菌株的基因组DNA进行扩增,对其指纹图谱进行 分析 ;回收并克隆重复性好的苏云金芽孢杆菌基因组DNA扩增片段,以其为探针,分别与供试菌株基因组DNA进行杂交。结果 与蜡状芽孢杆菌相比,苏云金芽孢杆菌菌株间基因组DNA指纹图谱较一致;所有供试苏云金芽孢杆菌菌株均扩增产生一条250bp左右的片段;苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌均可扩增产生600bp左右的共有DNA片段。此外,以苏云金芽孢杆菌500bp片段为探针与苏云金芽孢杆菌基因组DNA杂交有很好的特异性。结论 肠杆菌基因间重复一致序列-PCR指纹图谱可以正确反映苏云金芽孢杆菌与蜡状芽孢杆菌亲缘关系;500bp片段可以作为苏云金芽孢杆菌鉴定探针。 【关键词】 苏云金芽孢杆菌 苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis,Bt)与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus,Bc)同属于蜡状芽孢杆菌菌群,为 自然 界中广泛分布的革兰阳性菌〔1〕。其中Bt在其休眠期可形成对昆虫有毒性的伴胞晶体。因此,被作为生物杀虫剂广泛 应用 于农业及卫生害虫的生物防治;Bc则是人畜条件致病菌,可导致人食物中毒和感染,引起呕吐和腹泻〔2〕。 研究 表明,在自然环境中,两者染色体体外遗传物质可以出现高度重组〔3〕,在DNA水平也具有较高的同源性,只有个别碱基有差异〔4〕。由于Bt与Bc的相似性,许多细菌分类学家认为Bt与Bc应为同一个种〔5〕。Bt和Bc间的同源性关系,使Bt安全性 问题 越来越受到人们重视。因此,为研究两者的亲缘关系,对Bt的鉴定、Bt应用的安全性评价,以及进一步提高Bt杀虫效力、降低其致病风险,本文利用肠杆菌基因间重复一致序列(ERIC)-PCR技术〔6〕对Bt和Bc全基因组DNA进行扩增,对获得的Bt和Bc基因组DNA指纹图谱进行分析,探讨Bt和Bc起源进化关系,同时筛选并克隆了Bt基因组DNA扩增片段,对应用ERIC-PCR技术鉴别、鉴定Bt和Bc进行可行性探讨。结果报告如下。 1 材料与方法 11 材料 111 菌株 Bt 6株(菌株号为CGMCC 11749、CGMCC 11754、CGMCC 1294、CGMCC 1905、CGMCC 1989、CGMCC 11014),Bc标准株1株(菌株号为CGMCC 1126),大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等对照菌株各1株(菌株号分别为CGMCC 190、CGMCC 1933和CGMCC 189)〔购于 中国 普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)〕,Bc分离株2株为沈阳出入境检验检疫局分离,并经国标生化鉴定。 112 PCR引物及试剂 (1)ERIC引物: 由大连TaKaRa生物工程有限公司合成,引物序列分别为: PrimerⅠ:5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′,PrimerⅡ:5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′;(2)试剂:Ex-Taq酶、IPTG、X-gal(大连TaKaRa生物工程有限公司);pGEM-T vector连接转化试剂盒(pGEM-T vectorSystem Ⅱ)及JM109高效率感受态细胞(美国Promega公司);放射性同位素〔α-32P〕-dCTP和随机引物DNA标记试剂盒(Random Primer DNA Labeling System,英国Biolabs公司);尼龙膜及3MM滤纸(英国Whatman公司);其他试剂为本实验室自配,均为分析纯。 12 方法 121 菌株培养及其基因组DNA的提取 斜面活化的菌株在LB 培养基中30℃摇床培养过液(200r/min) ,离心收集2ml 培养的菌体(4000r/min ,10min ,20℃) ,采用实验室常规酚/氯仿法提取各菌株基因组DNA。所提取DNA经Beckman DU~640检测,吸光度A260/A280值在18~19之间,纯度符合PCR扩增条件。 122 ERIC-PCR反应条件及结果鉴定 (1)反应体系组成和反应条件:依据 文献 方法〔7〕。PCR产物进行15%琼脂糖凝胶电泳(U=3V/cm;T=100min)。DNA标准分子量为DL2000,PCR产物经溴化乙锭(EB)染色后在凝胶成像系统上照相。 123 PCR产物回收与克隆 将上述扩增产物利用15%琼脂糖凝胶电泳分离。选取重复性好的Bt基因组DNA扩增片段,使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。纯化产物连于pGEM-T载体,转入JM109感受态大肠埃希菌。连接反应、转化操作以及克隆子的鉴定按照常规方法进行;阳性克隆子用NaOH/SDS碱裂解法制备质粒DNA。 124 斑点杂交 按照随机引物DNA标记试剂盒(Random Primer DNA Labeling System)说明标记回收产物,以标记产物为探针,分别与供试菌株基因组DNA进行杂交。 125 引物设计及PCR验证 发生特异性杂交反应的克隆片段由大连TaKaRa生物工程有限公司进行测序。利用Primer Premier 50软件〔8〕,根据特异克隆片段序列信息设计引物,序列分别为:BthⅠ:5′CGAGCAGTAGGCGAACCATTG-3′BthⅡ:5′TGGCATGGGCTTTCGGATATT-3′。引物对应的扩增产物长度为363bp;PCR反应条件:94℃预变性2min;94℃30s,55℃30s,72℃30s,共30循环;72℃延伸5min。体系同ERICPCR。以6株Bt及其他对照菌株的染色体DNA作为模板,进行PCR反应。 2 结果 21 ERIC-PCR图谱(图1) 6株苏云金芽孢杆菌和3株腊状芽孢杆菌的基因组DNA经ERIC-PCR扩增,均可产生清晰的DNA指纹图谱,扩增片段范围100~2500bp,各菌株扩增图谱的多态性程度不同。Bt基因组DNA指纹图谱较一致,由3条主带构成,所有供试Bt菌株均有1条250bp左右的扩增片段,而蜡状芽孢杆菌间DNA指纹图谱变异较大。另外,Bt和Bc均可扩增得到600bp左右的共有片段。 1:CGMCC 11749; 2:CGMCC 11754; 3:CGMCC 1294 4:CGMCC 1905; 5:CGMCC 1989; 6:CGMCC 11846 7:CGMCC 1126; 8,9:Bc分离株 B:negative control-no DNA M:DL2000 图1 Bt、Bc基因组DNA ERIC-PCR结果指纹图谱(略) 22 斑点杂交(图2) 纯化、克隆指纹图谱中稳定出现的Bt DNA扩增片段,经DU-640测定浓度约为90μg/L,以其为探针对固定于膜上的供试菌株基因组DNA进行斑点杂交。结果显示,以500bp片段为探针,与苏云金芽孢杆菌杂交结果为阳性,枯草芽孢杆菌及属外的各菌株杂交结果为阴性。 23 PCR验证(图3) 根据特异克隆片段序列设计的BthⅠ和BthⅡ引物对,可以从Bt菌的基因组DNA中扩增出约360bp的片段,符合预期结果;而所有对照菌株均没有扩增条带,表明此特异片段来源于Bt菌基因组DNA。1~6:Bt菌株;7,8,9:Bc 菌株;10:枯草芽孢杆菌;11:大肠埃希菌;12:金黄色葡萄球菌 图2 500bp探针对各菌株杂交放射性自显影15d照片(略) 1~6:Bt菌株;7,8:Bc菌株; 9:大肠埃希菌 图3 引物BthⅠ和BthⅡ对Bt菌及对照菌DNA的扩增结果(略) 3 讨论 根据本 研究 得到的Bt指纹图谱的保守性和Bc指纹图谱的变异性可以推测出,Bt在进化过程中出现较晚,这与Carlson等的Bt可能是获得携有cry基因质粒的Bc变种的观点相符〔9〕。从本实验的扩增图谱中还可看出,Bt亚种tolworthi HD125与其他Bt菌株的主带型一致,这一结果与Carlson 和 Kolsto关于肠毒素基因阴性Bt菌株起源的观点一致,即Bc获得cry基因后,进化为肠毒素基因阳性Bt菌株,然后失去该基因进化为肠毒素基因阴性Bt菌株〔10〕。另外,Bt与Bc均可扩增产生600bp左右的共有DNA片段,体现了二者在遗传上的高度同源性。因此,ERIC指纹图谱可以正确反映出Bt与Bc的亲缘关系。由于Bt和Bc间的同源性关系,Bt安全性 问题 越来越受到人们重视〔11,12〕。本研究筛选到的500bp片段可作为苏云金芽孢杆菌的鉴定用探针。 【 参考 文献 】 〔1〕 David A Rasko,Michael R Altherr,Cliff S Han,et al.Genomics of the bacillus cereus group of organisms[J].FEMS Microbiology Reviews,2005,29:303-329. 〔2〕 Lund T,Granum P E,Sullivan K O. The sequence of the non-haemolytic enterotoxin operon from bacillus cereus[J].FEMS Microbiol Lett,1999,178:355-361. 〔3〕 袁志明,蔡全信,Andrup L,et al.苏云金芽胞杆菌肠毒素基因的PCR检测[J].微生物学报,2001,41(2):148-154. 〔4〕 M C te Giffel,R R Beumer,N Klijn,et al.Discrimination between bacillus cereus and bacillus thuringiensis using specific DNA probes based on variable regions of 16S rRNA[J].FEMS Microbiology Letters,1997,146:47-51. 〔5〕 Sergei G Bavykin,Yuri P Lysov,Vladimir Zakhariev,et al.Use of 16S rRNA,23S rRNA and gyrB gene sequence analysis to determine phylo-genetic relationships of bacillus cereus group microorganisms[J].Journal Of Clinical Microbiology,2004,8:3711-3730. 〔6〕 金莉莉,王秋雨.ERIC-PCR技术鉴定单核细胞增生性李斯特氏菌[J]. 中国 公共卫生,2003,19(7): 879. 〔7〕 金莉莉,王秋雨,侯萧.ERIC-PCR技术在李斯特氏菌种、菌株鉴定中的 应用 [J].遗传,2003,25(2):195-197. 〔8〕 赵雨杰.医学生物信息学[M].北京:人民军医出版社,2002:170-175. 〔9〕 Carlson,C R Caugant D A,et al.Genotypic diversity among Bacillus thuringiensis strains[J].Appl Environ Microbiol,1994,60:1719-1725. 〔10〕 Sin-ichiro A,Yuki N,Hisanori B,et al.Takashi Y.Cloning of novel enterotoxin genes from bacillus cereus and bacillus thuringiensis[J].Applied and Environmental Microbiology,1997,1054-1057. 〔11〕 Granum PE,O'Sullivan K,Lund T.The sequence of the non-haemolytic enterotoxin operon from bacillus cereus[J].FEMS Microbiol Lett,1999,178:225-229. 〔12〕 Bernstein L,Bernstein J A,Miller M,et al.Immune responses in farm workers after exposure to bacillus thuringiensis pesticides[J].Environmental Health Perspectives,1999,107:575-582.
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