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中药多酚超声瞬时提取工艺拟合和质量评价
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【西药学论文】作者：叶勇，张永波 陈焕仪 朱全红【摘要】 目的 研究超声瞬时提取工艺对中药多酚成分的影响，对其工艺进行评价，并进行工艺模型拟合。方法采用超声瞬时提取方法对叶下珠、茶叶、丹参中多酚类进行提取，HPLC测定其有效成分没食子酸、EGCG和丹参素含量;采用均匀设计和多元线性回归对超声瞬时提取的工艺参数和多酚产率进行了回归拟合，优化工艺参数;对工艺耗能进行计算。结果超声瞬时提取工艺较10 min煎煮法和1 h超声法有效成分含量分别可高1～3倍和1～5倍。常规煎煮法(2 h)其耗能是超声瞬时提取的60倍。不同药材其回归方程有所不同，但颗粒度影响均较大。结论超声瞬时提取工艺是一种高效节能工艺，适用于中药多酚类提取。
【关键词】 超声瞬时提取; 多酚; 工艺参数; 回归模型; 能耗
Abstract：ObjectiveTo study the effect of instantaneous ultrasonic extraction on polyphenols in Chinese herbs, evaluate this technique, and create the regression equation.MethodsInstantaneous ultrasonic extraction was used to extract polyphenol separately from herbs of Phyllantuus urinaria L., leaves of Camellia sinensis L. and root of Salvia miltiorrhiza Bunge. Gallic acid, EGCG and Salvianic acid were determined by HPLC. The uniform design and multi-linear regression were applied to obtain the equation about the relationship between process parameters and polyphenol yield rate, and optimize the process conditions. Energy consumption of the technique was calculated. ResultsPolyphenol content extracted by this method could be 1～3 times or 1～5 times more than that extracted by water boiling for 10 min or ultrasonic extraction for 1h. The energy consumption in water boiling extraction for 2h was 60 times more than in instantaneous ultrasonic extraction for 10 min. The regression equations were different in various herbs, and all were obviously affected by granularity. Conclusion Instantaneous ultrasonic extraction is the technique with high efficiency and low energy consumption, it is practicable to be used in extraction of polyphenols in Chinese herbs.
Key words： Instantaneous ultrasonic extraction; Polyphenol; Process parameter; Regression model; Energy consumption
提取是中药制药工艺中的首要环节。目前的中药提取均是采用传统的煎煮工艺，一般以水或醇为溶剂，加热回流1～2 h并提取2～3次。这种工艺不仅耗能，而且对热敏性的有效成分造成了较大的破坏。因此有必要对传统热提取工艺进行改革和创新。低温和快速可以减少热敏性成分的破坏。冷提取、超临界萃取可实现冷提取，微波萃取可实现快速提取。但直接冷浸提取率低。超临界提取虽然得率较高，但仍然需要一定温度和压力，且设备投资大[1]。微波萃取的温度高，不宜长时间操作，由于设备限制，对大量提取仍有一定困难[2]。超声提取作为一种低温提取技术，可利用超声波的机械效应、空化效应，加强了细胞内物质的释放、扩散和溶解，加速了有效成分的浸出[3]。但长时间超声也会升高环境温度，对热敏性有效成分是不利的。因此研究超声瞬时提取具有重要意义。
多酚类化合物是中药的一类有效成分，在受热条件下易被氧化破坏。如茶叶中的主要活性成分儿茶素[4]、丹参中的主要成分丹酚酸[5]、叶下珠中的主要成分没食子酸[6]等。本项研究以多酚为切入点，研究超声瞬时提取技术的工艺参数优化、模型拟合和耗能分析，有助于开发一种新型节能的提取技术。
1 器材
1.1 药材和试剂叶下珠药材为大戟科叶下珠Phyllantuus urinaria L.的干燥全草，广东产。茶叶为山茶科植物茶树Camellia sinensis L.的叶加工的浙江龙井一级，浙江产。丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根，湖北产。EGCG和丹参素对照品购自中国药品生物制品检定所。没食子酸等其它试剂均为分析纯，乙腈、甲醇为色谱纯。
1.2 仪器超声仪，KQ-50E型,江苏昆山超声仪器公司，频率25kHz，功率50W。紫外分光光度仪，UV2800型，天津托普仪器有限公司。高效液相色谱仪，Agilent 1100型，美国Agilent公司生产。
2 方法
2.1 超声瞬时提取方法将药材粉碎至16～200目，加入0～80%的乙醇溶液，药液比1∶10～1∶26，调整提取液的pH 3～7，设定提取温度10～35℃，提取时间30～600s，按均匀设计表分配参数。过滤后，取滤液测定多酚含量，考察多酚提取率。按下式计算，多酚提取率(%)=C×V m×10-6×100%，式中：C为根据测得的吸光度值换算成多酚浓度(μg/ml);V为提取液体积(ml);m为药材质量(g)。
2.2 均匀设计实验以药材多酚的提取率为考察指标，考察乙醇浓度X1、提取时间X2、提取温度X3、料液比X4、pH值X5、物料粒度X6等6个因素，将上述参数设为9个水平，以U9(96)均匀设计表安排实验[7]。见表1。表1 U9(96)均匀设计表因素与水平
2.3 多酚含量测定叶下珠中总酚的含量采用酒石酸亚铁比色法[8]，茶叶中儿茶素的含量采用香草醛法[9]，丹参中酚酸含量采用硝酸铝络合比色法[10]。其浓度与吸光度值符合线性关系，见表2。表2 多酚比色测定标准曲线
2.4 有效成分含量测定采用HPLC法，将药材提取液经微滤膜过滤后进样分析。叶下珠测定没食子酸含量[11]，茶叶测定EGCG含量[12]，丹参测定丹参素含量[13]。
色谱条件：色谱柱Agilent Hypersil ODS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流动相：叶下珠为甲醇-0.1%磷酸(10∶90)，茶叶为乙腈-水-冰乙酸(15∶84∶1)，丹参为乙腈-甲醇-水-甲酸(20∶55∶24∶1)，检测波长分别为271 ，280 ，276 nm。流速1 ml/min，柱温30℃，检测时间20 min，进样量10 μl。其峰面积与含量呈线性关系。见表3。表3 没食子酸、EGCG、丹参素标准曲线
2.5 统计分析采用DPS软件，对均匀设计结果进行数据模拟和统计分析。
2.6 耗能分析将实验装置的功率累计，按公式计算：耗能=(超声功率+加热功率)×提取时间。
3 结果
3.1 超声瞬时提取工艺参数的拟合对叶下珠、茶叶和丹参药材进行超声提取，其多酚的提取率见表4。表4 均匀设计的实验结
对3种药材的多酚提取率与相应提取参数进行逐步回归。分别采用二次多项式逐步回归、多因子及互作项逐步回归、多因子及平方项逐步回归。对于叶下珠药材以二次多项式回归方程显著性差异最大，相关性最好，误差最小。其回归方程为：Y=-0.166 4 +0.019 2X1 -0.000 3X3 -0.0002X12 +0.000 02X62 +0.000 04X1X3 -0.000 03X1X6 -0.000 05X3X5 ，R=1.000 0, S=0.0001, F=71 428.464 3。
优化后指标及参数值：Y=0.833，X1=33，X2=599，X3=75，X4=1:10，X5=3.0，X6=200。
该方程表明，各因素中提取时间、加液量和pH对提取率的影响较小，而乙醇浓度、温度和药材颗粒度对其影响较大。从优化的结果看，30%乙醇、提取时间600 s，温度75℃，料液比1∶10，pH3.0、药材颗粒度200目，可以达到最大提取效果。以该条件提取3次，平均提取率为0.29%，与目标值虽然存在差异，但提取率较高，说明该回归方程具有一定参考价值。
同样方法考察茶叶和丹参药材。茶叶儿茶素提取率以多因子及平方项逐步回归方程的显著性最大。其方程为：Y=-2.573 6 +0.145 8X1 +0.010 35X2 -63.924 9X4 +0.240 7X6 -0.000 02X22 +0.000 5X32 -0.001 2X62，R=0.999 9, S=0.036 7, F=4 661.738 6。
优化后指标及参数值：Y=14.988，X1=32，X2=450，X3=66，X4=1∶26，X5=5.0，X6=77
从该方程可知，pH和温度对其贡献较小，而加液量、乙醇浓度、提取时间和药材颗粒度影响较大。优化结果表明，30%乙醇、提取时间450s，温度65℃，料液比1∶26，pH5.0，药材颗粒度80目，可以达到最大提取效果。以该条件提取3次，平均提取率为11.28%，处较高水平，说明该回归方程可用。
丹参中酚酸的提取率也以多因子及平方项逐步回归方程的显著性最大，其方程为：Y=17.544 6 -0.087 0X3 -178.056 8X4 -0.0145X6 -0.000 8X12 +0.001 5X32 +770.7846X42 +0.000 05X62 ， R=0.999 9, S=0.014 5, F=5 875.609 3。优化后指标及参数值：Y=8.244，X1=80，X2=599，X3=75，X4=1∶27，X5=6.3，X6=206。
从该方程可知，乙醇浓度、提取时间和pH对其贡献较小，而加液量、温度和药材颗粒度影响较大。优化结果表明，80%乙醇、提取时间600 s，温度75℃，料液比1:27，pH6.0，药材颗粒度200目，可以达到最大提取效果。以该条件提取3次，平均提取率为8.23%，与优化结果较近，处于较高水平，说明该回归方程可用。
以上回归拟合结果表明，不同药材多酚提取优化后参数有较大差异，但存在共性，即pH对提取率的影响小，而药材颗粒度影响大。酸性环境有利于多酚类的稳定，但由于提取时间不长，对提取率的贡献则不大。由于颗粒度大小直接关系到药物成分的扩散，故对不同药材均有较大影响。茶叶作为叶类药材，超声后细胞易破碎，无需粉碎过细，80目即可达到最大提取，而叶下珠为全草，丹参为根类药材，细胞难破碎，需要较细的粉碎度才可达到最大量提取。
3.2 超声瞬时提取对有效成分的影响以等量药材，按照均匀设计优化后条件进行超声瞬时提取，同时设置一长时间超声提取(60 min)和等时间(10 min)煎煮提取为对照。进行多酚提取率的测定，并取其提取液对其组成进行HPLC分析。分别比较了叶下珠中没食子酸、茶叶中EGCG和丹参中丹参素的含量及提取率。结果见表5。
表5 不同提取方法没食子酸、EGCG、丹参素的含量与提取率%
方法没食子酸含量提取率EGCG含量提取率丹参素含量提取率超声瞬时提取17.5530.28619.39111.3158.7358.25210min煎煮法5.7300.24814.6277.5604.9857.40360min超声法3.3180.25618.7888.9202.9187.360
3种提取方法相比较，超声瞬时提取最优，其多酚提取率最高，其中主要有效成分含量也最高。煎煮法提取时间相同，但未使用超声。由于提取温度高，其含量低了1～3倍，提取率也低。长时间超声处理，造成了多酚成分的破坏。超声时间延长6倍，其主要多酚成分含量下降了1～5倍，提取率也有所下降。
3.3 不同提取方法能耗比较本实验采用的超声仪的功率为50W，加热器的功率为1 500 W。超声瞬时提取只需10 min，加上热补充提取，其耗能为1.5×105 J。而常规煎煮法加热时间为2～3 h，其耗能以2 h计为9.0×106 J，高于超声瞬时提取60倍。由此可见，超声瞬时提取可以大量节约能源。
4 讨论
不同药材具有不同提取规律，需采用不同的回归方程拟合。但它们也存在共性，如药材颗粒度的影响显著。超声瞬时提取与药材颗粒度密切相关，增加颗粒度使药材呈微粒状态，增加了有效成分的扩散面积。同时利用超声使细胞破碎，加速有效成分的溶出。但对于叶类药材，无须过高的颗粒度，即可保证成分的快速溶出。超声瞬时提取克服了中药热提取过程耗能费时并对有效成分造成破坏的缺点，采用完全不同于传统煎煮提取工艺。该工艺提取时间短，10 min内即可完成，多酚成分的保留率显著高于煎煮法和长时间的超声提取。能耗也只有传统煎煮工艺的1/60。
多酚类化合物是中药的一类有效成分，热稳定性差。本项目以多酚为参照进行超声瞬时提取，确定超声瞬时提取的主要影响因素，为中药多酚类化合物的高效节能提取工艺提供了依据。
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