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邻苯二甲酸二其它医学
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【中药制剂论文】 作者：宋晓峰，魏光辉，邓永继，张德迎，陈旋，刘星【关键词】 二甲酸二【Abstract】 AIM: To explore the mRNA expression of INSL3 gene in Leydig cells of fetal and neonatal mice exposed to di(2ethylhexyl)phthalate (DEHP) in vivo and in vitro. METHODS： The Leydig cells were isolated from fetal mouse testis and were cultured in DMEM/F12 medium and identified by 3 betahydroxysteroid dehydrogenase (3βHSD). Reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) and in situ hybridization were used to examine the expression levels of INSL3 mRNA in primarily cultured Leydig cells incubated with DEHP (at the dose of 50，100，200 mg/L, respectively). Pregnant mice were exposed to DEHP at the dose of 100， 200 or 500 mg/kg body weight per day by gavage from gestation day (GD) 12 to postnatal day （PND） 3. The expression of INSL3 gene in neonatal mouse testis was investigated by RTPCR. RESULTS: Histological alterations of primarily cultured Leydig cells and neonatal mouse testis exposed to DEHP were observed. The expression level of INSL3 mRNA in DEHP treated groups including the primarily cultured Leydig cells and male mouse offsprings testis were lower than those of the control groups. CONCLUSION: DEHP can downregulate the expression level of INSL3 mRNA in Leydig cells in vitro and in vivo. It may be a possible mechanism that DEHP interferes with gubernaculum development and causes cryptorchidism.
【Keywords】 Di(2ethylhexyl), phthalate；fetus；Leydig cell；in situ hybridization ；RTPCR
【摘要】 目的：通过体内体外实验探讨邻苯二甲酸二（2乙基）己酯(DEHP)对胚胎及新生小鼠睾丸Leydig细胞INSL3 mRNA表达的 影响 . 方法 ：DEHP 50，100，200 mg/L分别作用于原代培养的小鼠胚胎Leydig细胞， 应用 RTPCR和原位分子杂交技术检测DEHP对Leydig细胞INSL3 mRNA表达的影响；DEHP分别以低、中、高三组剂量（100，200和500 mg/kg・d）灌胃作用于GD（Gestation day）12～PND（Postnatal day）3孕鼠，RTPCR检测新生小鼠睾丸INSL3 mRNA表达的相对强度. 结果：DEHP改变原代培养的小鼠胚胎Leydig细胞和新生小鼠睾丸的形态结构；各实验组包括原代Leydig细胞及不同时间点的新生鼠睾丸INSL3 mRNA表达水平、表达相对强度均明显低于对照组(P<0.05,或P<0.01). 结论：DEHP下调小鼠睾丸Leydig细胞INSL3 mRNA的表达,可能是影响引带发育导致隐睾的机制之一.
【关键词】 2乙基己基,邻苯二甲酸；胚胎；Leydig细胞；原位分子杂交；逆转录聚合酶链反应
0引言
邻苯二甲酸二（2乙基）己酯（DEHP），是塑料 工业 中广泛使用的增塑剂，是邻苯二甲酸酯类化合物（PAE）中的一种，也是公认的环境内分泌干扰物，可影响机体内分泌的活性. 研究 发现邻苯二甲酸酯类化合物与先天性疾病如隐睾、尿道下裂等的发病具有明显的相关性［1-3］. 我们拟通过体内体外实验研究DEHP对胚胎及新生小鼠睾丸Leydig细胞胰岛素样因子3(INSL3) mRNA表达的影响，探讨其与隐睾发病的相关分子机制.
1材料和方法
1.1材料昆明小鼠由重庆医科大学动物中心提供,合格证号为SYXK（渝）20040001. 孕期 计算 以成年雌雄小鼠合笼后，雌鼠见阴栓为受孕0 d. DMEM/F12(Hyclone公司),胎牛血清（天津TBD公司），DEHP（上海化学试剂有限公司），玉米油（美国Sigma公司），Trizol（Gibco公司），TaqDNA聚合酶、MMLV逆转录酶、dNTP(Promega公司)，原位杂交试剂盒（博士德公司），引物：INSL3，βactin引物序列应用软件Primer自行设计，由上海生工生物公司合成.
1.2方法
1.2.1睾丸Leydig细胞的分离、培养、鉴定取孕16 d母鼠子宫内雄性仔鼠睾丸Leydig细胞培养、纯化、鉴定，方法见 文献 ［4］.
1.2.2原位分子杂交检测分离的胎鼠Leydig细胞接种入放有爬片的培养板内，密度1×108个/L，培养72 h后，换液，培养板孔内加入等量的不同浓度的DEHP血清溶液（培养液内药物终浓度分别为50，100和200 mg/L），空白对照组不加药，溶剂对照组加入等量的血清. 每个药物浓度为1组，每组作8个平行孔，培养12 h，取出Leydig细胞爬片，每组3张爬片苏木素－伊红染色(HE)，观察细胞形态变化，余下5张采用原位分子杂交技术检测睾丸Leydig细胞INSL3 mRNA的表达. 探针由地高辛标记，按试剂盒说明书操作，以不含探针的杂交液设立阴性对照，阳性细胞胞质着色呈棕黄色. 图像 分析 测定细胞质棕黄色染色平均A值，反映INSL3 mRNA表达的强弱.
1.2.3逆转录聚合酶链反应(RTPCR)总RNA提取：①培养细胞总RNA提取：培养瓶中接种入Leydig细胞，密度为1×108个/L，培养72 h后，换液，培养液内加入DEHP血清溶液(培养液内药物浓度分别为50，100和200 mg/L)，溶剂对照组加入等量血清，空白对照组不加药. 每个药物浓度为1组，每组5个培养瓶，继续培养12 h，倾去培养液，pH 7.2，0.1 mol/L PBS液冲洗2次,参照Trizol说明书一步法分别提取各培养瓶中总RNA. ②新生小鼠睾丸组织总RNA提取：把妊娠12 d的健康KM孕鼠随机分成5组：空白对照组、玉米油对照组、DEHP 100 mg/kg・d组、DEHP 200 mg/kg・d组、DEHP500 mg/kg・d组，每组10只. 自妊娠期第12日（Gestation day, GD12）至分娩后第3日（Postnatal day 3，PND 3），将不同剂量DEHP溶于玉米油中，于每日早上8时灌胃给药，玉米油对照组剂量为玉米油2 mL/kg・d，空白对照组不给药. 于生后5，15 d分别从各组中随机处死12只雄性仔鼠，取双侧睾丸，其中每组每个时间点取2只小鼠的睾丸100 g/L甲醛固定，HE染色，光镜观察，其余睾丸用Trizol分别提取总RNA. ③RNA产物经紫外分光光度计测定A260 nm/A280 nm比值，均大于1.8. ④RTPCR：引物序列：INSL3上游引物：5′tgcagtggctagagcagaga3′，下游引物：5′tgcaatgacatagccaggag3′，扩增产物大小为248 bp；内参照βactin上游引物：5′tgttaccaactgggacgaca3′，下游引物：5′ggggtgttgaaggtctcaaa3′，扩增产物大小为165 bp. 取5 μL总RNA进行RT反应，反应体积20 μL. 取4 μL RT产物作为模板，反应体积25 μL，每管加入INSL3上下游引物、βactin上下游引物各1 μL，10倍浓度缓冲液2.5 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，加去离子水至25 μL. 扩增条件：94 ℃变性1 min，55℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；扩增35个循环. ⑤PCR产物检测及半定量：取3 μL PCR产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶分析系统对扩增产物条带进行扫描，以INSL3条带密度与内参照βactin条带密度的比值（A值）来表示目的产物的相对表达强度.
统计学处理： 数据用x±s表示，采用SPSS 12.0统计软件，多组间均数比较采用方差分析，两两比较采用LSDt检验,P<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1原代培养的Leydig细胞纯度、形态学改变GD16胎鼠睾丸组织消化后的细胞悬液台盼蓝染色显示细胞存活率为(80.88±2.80)％. 培养前、培养72 h后细胞经3βHSD染色鉴定，Leydig细胞纯度分别为(45.10±1.66)％（n=10），(81.17±2.32)％（n=10）. 光镜下贴壁Leydig细胞透明，基本无颗粒，细胞轮廓清楚，增殖的细胞呈纤维细胞样生长，相互连接成单层膜状，3～4 d完全汇合. 细胞爬片HE染色及吖啶橙染色荧光显微镜下观察，Leydig细胞核呈圆形或卵圆形，嗜碱性，大多位于细胞中央,核仁1～2个，一般位于核的边缘部,其胞质轮廓为多角形，一般有3～4个突起. 加入一定浓度DEHP并作用相当时间后细胞增殖速度变慢，细胞轮廓变明显，细胞质粗糙，内有颗粒堆积，并出现空泡. 严重者细胞增殖停止，贴壁细胞脱落，上浮，崩溃溶解.
2.2新生小鼠睾丸组织学改变光镜下，对照组PND 5小鼠生精小管呈实心的索状（性索），PND15小鼠部分生精小管开始管腔化，生精细胞层次少，层次清楚，约3～4层，细胞结构正常. 睾丸间质分布于生精小管之间，比较疏松,Leydig细胞数量少，散在分布. Leydig细胞大，核圆形或椭圆形，位于细胞中央（图1A）. DEHP各剂量组小鼠睾丸均出现明显的病理性改变：生精细胞程度不等的变性，细胞核边界不清楚，核形状不规则；Leydig细胞数量增多，以中、高剂量组PND 15小鼠睾丸为甚，Leydig细胞变性，细胞核不规则，胞质及部分胞核内见大小不一的空泡，细胞常聚集成团，或排列成较大的细胞簇（图1B，C）.
2.3原代Leydig细胞INSL3 mRNA的表达溶剂对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；DEHP 50 mg/L组平均A值比对照组低（0.106±0.011 vs 0.122±0.013, 0.120±0.010, P<0.05）；DEHP 100和200 mg/L组与对照组、DEHP 50 mg/L组比较，A值降低（0.078±0.008, 0.072±0.008 vs 0.122±0.013, 0.120±0.010, 0.106±0.011, P<0.01).
2.4原代Leydig细胞及新生小鼠睾丸INSL3 mRNA的表达相对强度溶剂对照组与空白对照组差异无统计学意义（0.958±0.084 vs 0.982±0.063, P>0.05）；各实验组(DEHP 50, 100和200 mg/L组)INSL3 mRNA表达相对强度比对照组降低（0.820±0.050, 0.756±0.078, 0.702±0.052 vs 0.958±0.084, 0.982±0.063, P<0.05或P<0.01）；DEHP 50 mg/L与DEHP 200 mg/L组两两比较差异有统计学意义（0.820±0.050 vs 0.702±0.052, P<0.05）. 提示：在体外，DEHP抑制Leydig细胞INSL3 mRNA的表达，且效应与剂量有关.
如表1所示，DEHP处理各组的INSL3 mRNA的表达相对强度在雄性仔鼠出生早期（PND 5）与对照组比较，即明显降低（P<0.01），实验组组间两两比较也有差异（P<0.01）；在PND15时，DEHP处理各组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），DEHP 500 mg/kg・d组INSL3 mRNA的表达相对强度比其他两个实验组高，但实验组两两比较差异无统计学意义（P>0.05）；DEHP实验组与对照组表1新生小鼠睾丸Leydig细胞INSL3 mRNA相对表达强度的检测（略)比较，INSL3 mRNA表达相对强度的差异在PND15时较PND5有变小的趋势. 提示：DEHP对雄性仔鼠睾丸INSL3 mRNA的表达有影响，其影响与DEHP的剂量有关，差异随仔鼠体外生活时间的延长有变小的趋势.
3讨论
INSL3,睾酮（testosterone）以及抗苗勒氏管激素（antiMullerian hormone,AMH）,对于动物正常的性分化发育起关键作用，如果这三种激素分泌紊乱，将导致动物泌尿生殖系统先天性畸型，如隐睾等［5］. 隐睾为小儿时期最常见的泌尿生殖系统畸型，在足月男婴发生率达3％～4％，是男性不育的主要原因，其发生机制至今不清楚. 早期 研究 认为睾丸下降分为经腹腔下降和经腹股沟阴囊下降两个阶段，睾丸引带(gubernaculum)和颅侧悬韧带在整个下降过程中发挥重要作用［6］. Emmen等［7］研究发现INSL3、睾酮等作用下的胚胎期睾丸引带发育和颅侧悬韧带退化是保证睾丸正常下降的关键因素，经腹腔下降期主要由INSL3诱导睾丸引带细胞增生，同时，睾酮促进颅侧悬韧带退化，促使睾丸从腹腔内下降到腹股沟，经腹股沟阴囊下降期睾酮进一步促进睾丸引带发生退化、收缩，引导睾丸从腹股沟降入阴囊内. 在剔除了INSL3基因的小鼠模型中，INSL3-纯合子(INSL3-/-)小鼠发生双侧腹腔内高位隐睾，而分化发育依赖雄激素的雄性生殖器官相对正常；雄性INSL3-/-胎鼠组织学显示,Wollfian管结构正常，苗勒氏管消失，而引带发育受到严重 影响 ，睾丸引带细小，分化不良，没有位于中央的间叶细胞带，提示INSL3-/-小鼠的睾酮和AMH的分泌正常，引带的发育不良与INSL3基因缺失密切相关［8］. LGR8/Great被认为是INSL3与之结合并发挥作用的唯一受体，主要表达于睾丸引带、附睾等组织. 在转染细胞中LGR8能与极低浓度的INSL3特异性结合并促进睾丸下降,LGR8基因突变，缺失都可以引起引带发育异常和隐睾发生［9-11］. 因此INSL3被认为是促进睾丸正常下降的重要激素.
大量研究证实INSL3由睾丸Leydig细胞分泌，如果睾丸Leydig细胞受各种理化因素影响，INSL3分泌功能发生紊乱，将间接影响睾丸引带的发育及分化. 睾丸Leydig细胞是环境内分泌干扰因子DEHP作用的靶细胞之一［12-13］，我们前期研究发现DEHP通过对小鼠孕鼠灌药，可成功诱导出仔鼠隐睾模型［14］. 在此基础上，我们在本实验中，进一步观察DEHP对胚胎及新生小鼠睾丸Leydig细胞INSL3 mRNA表达的影响，结果发现DEHP对原代培养的睾丸间质细胞有明显的增殖抑制作用，贴壁生长的细胞脱落，上浮，崩溃溶解，死亡细胞数增加；胚胎期接触DEHP的仔鼠睾丸Leydig细胞不同程度的变性，细胞核不规则，胞质及部分胞核内出现大小不一的空泡，细胞聚集成团，或排列成较大的细胞簇，而接触中、高剂量DEHP的仔鼠睾丸Leydig细胞反应性增生. 通过原位分子杂交技术和RTPCR检测,各实验组INSL3 mRNA表达水平与对照组比较差异有统计学意义，提示DEHP可有效下调INSL3 mRNA的表达. 在体实验中，DEHP 500 mg/kg・d组在PND15时，睾丸组织学可见Leydig细胞数量明显增多，但INSL3 mRNA表达的相对强度仍低于对照组（P<0.05）,表明反应性增生的Leydig细胞发育不成熟，功能不完善. 小鼠睾丸INSL3 mRNA表达相对强度与对照组比较，在PND15时其差异程度比PND5时有减小的趋势，提示：DEHP对Leydig细胞INSL3 mRNA表达的抑制可能呈阶段性. 推测DEHP间接影响睾丸引带的发育，是导致隐睾发生的机制之一.
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