| 中文摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-17页 |
| 1.1 金黄色葡萄球菌耐药现状 | 第11页 |
| 1.2 溶葡球菌酶的发现 | 第11页 |
| 1.3 溶葡球菌酶理化特性 | 第11页 |
| 1.4 溶葡球菌酶作用机制 | 第11-13页 |
| 1.5 溶葡球菌酶基因异源表达 | 第13-15页 |
| 1.5.1 原核表达系统 | 第13-14页 |
| 1.5.2 真核表达系统 | 第14-15页 |
| 1.6 乳酸克鲁维酵母表达系统 | 第15页 |
| 1.7 溶葡球菌酶应用前景 | 第15-16页 |
| 1.8 本研究的目的及意义 | 第16-17页 |
| 第二章 溶葡球菌酶基因载体构建及在乳酸克鲁维酵母中重组表达、活性检测 | 第17-27页 |
| 2.1 实验材料 | 第17页 |
| 2.1.1 实验试剂 | 第17页 |
| 2.1.2 主要实验试剂配制 | 第17页 |
| 2.2 实验仪器 | 第17页 |
| 2.3 实验方法 | 第17-21页 |
| 2.3.1 溶葡球菌酶基因克隆 | 第17-18页 |
| 2.3.2 质粒提取 | 第18页 |
| 2.3.3 PUC57-Lys质粒和PKLAC1载体双酶切 | 第18页 |
| 2.3.4 PUC57-Lys质粒和PKLAC1载体双酶切后切胶回收 | 第18-19页 |
| 2.3.5 溶葡球菌酶基因(Lys)与PKLAC1载体的连接、转化 | 第19-20页 |
| 2.3.6 阳性克隆PCR测序 | 第20页 |
| 2.3.7 重组菌株的诱导表达 | 第20-21页 |
| 2.3.8 溶葡球菌酶标准曲线 | 第21页 |
| 2.3.9 重组溶葡球菌酶抗菌活性检测及活性定义 | 第21页 |
| 2.4 实验结果 | 第21-26页 |
| 2.4.1 溶葡球菌酶目的基因克隆 | 第21-22页 |
| 2.4.2 重组表达载体pKLAC1-Lys构建及重组质粒鉴定 | 第22-23页 |
| 2.4.3 重组表达载体pKLAC1-Lys转化乳酸克鲁维酵母 | 第23-24页 |
| 2.4.4 阳性克隆测序 | 第24-25页 |
| 2.4.5 溶葡球菌酶标准曲线 | 第25页 |
| 2.4.6 重组表达的溶葡球菌酶抗菌活性检测 | 第25-26页 |
| 2.5 讨论 | 第26-27页 |
| 第三章 对高表达菌株(8 | 第27-45页 |
| 3.1 实验材料 | 第27-28页 |
| 3.1.1 主要实验试剂及设备 | 第27页 |
| 3.1.2 主要实验试剂的配制 | 第27-28页 |
| 3.2 实验方法 | 第28-32页 |
| 3.2.1 NTG诱变实验 | 第28-29页 |
| 3.2.2 诱变菌株的诱导表达 | 第29页 |
| 3.2.3 mu4 | 第29页 |
| 3.2.4 诱变菌株表达条件探究[36,40] | 第29-30页 |
| 3.2.5 mu4 | 第30页 |
| 3.2.6 镍柱制备 | 第30页 |
| 3.2.7 溶葡球菌酶的纯化 | 第30-31页 |
| 3.2.8 溶葡球菌酶SDS-PAGE | 第31页 |
| 3.2.9 扫描电镜制样 | 第31页 |
| 3.2.10 溶葡球菌酶发酵工艺优化 | 第31-32页 |
| 3.3 实验结果 | 第32-43页 |
| 3.3.1 高表达菌株(K. lactis GG799/p KLAC1- Lys 8 | 第32-33页 |
| 3.3.2 诱变后高表达菌株 mu4 | 第33页 |
| 3.3.3 mu4 | 第33-36页 |
| 3.3.4 mu4 | 第36-39页 |
| 3.3.5 表达产物的纯化及鉴定 | 第39-41页 |
| 3.3.6 重组溶葡球菌酶发酵上清液对金黄色葡萄球菌细胞产生的影响 | 第41-42页 |
| 3.3.7 100 L规模放大发酵实验 | 第42-43页 |
| 3.4 讨论 | 第43-45页 |
| 第四章 鸡源抗菌肽Fowlicidin-1基因在毕赤酵母中重组表达研究 | 第45-64页 |
| 4.1 抗菌肽Fowlicidin-1研究进展 | 第45-48页 |
| 4.1.1 抗菌肽 | 第45页 |
| 4.1.2 抗菌肽Fowlicidin-1来源 | 第45页 |
| 4.1.3 抗菌肽Fowlicidin-1理化特性及生物学功能 | 第45页 |
| 4.1.4 抗菌肽Fowlicidin-1作用机理 | 第45-47页 |
| 4.1.5 毕赤酵母表达系统 | 第47页 |
| 4.1.6 抗菌肽Fowlicidin-1应用前景 | 第47-48页 |
| 4.1.7 本文研究的目的及意义 | 第48页 |
| 4.2 实验材料与试剂 | 第48-49页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第48页 |
| 4.2.2 主要试剂 | 第48页 |
| 4.2.3 实验试剂的配制 | 第48-49页 |
| 4.3 实验方法 | 第49-52页 |
| 4.3.1 鸡源抗菌肽Fowlicidin-1基因序列优化与载体构建 | 第49页 |
| 4.3.2 Fowlicidin-pPIC9K质粒的提取 | 第49页 |
| 4.3.3 Fowlicidin-pPIC9K质粒线性化 | 第49页 |
| 4.3.4 电击转化毕赤酵母(SMD1168)感受态细胞 | 第49-50页 |
| 4.3.5 SMD1168/pPIC9K-F菌株阳性克隆筛选及诱导表达 | 第50页 |
| 4.3.6 SMD1168/pPIC9K-F菌株表达的发酵上清液抑菌活性检测 | 第50页 |
| 4.3.7 抗菌肽效价检测 | 第50-51页 |
| 4.3.8 SMD1168/pPIC9K-F菌株生长曲线 | 第51页 |
| 4.3.9 Fowlicidin-pPIC9K质粒丢失率 | 第51页 |
| 4.3.10 SMD1168/pPIC9K-F菌株分泌表达的抗菌肽发酵上清液热稳定性 | 第51页 |
| 4.3.11 SMD1168/pPIC9K-F菌株分泌表达的抗菌肽发酵上清液pH耐受性 | 第51页 |
| 4.3.12 SMD1168/pPIC9K-F菌株分泌表达的抗菌肽(Fowlicidin-1)抗菌谱研究 | 第51-52页 |
| 4.3.13 SMD1168/pPIC9K-F菌株分泌表达的抗菌肽(Fowlicidin-1)溶血性实验 | 第52页 |
| 4.3.14 SMD1168/pPIC9K-F菌株分泌表达的抗菌肽(Fowlicidin-1)质谱(MS)鉴定 | 第52页 |
| 4.4 实验结果 | 第52-62页 |
| 4.4.1 pPIC9K-F载体构建 | 第52-53页 |
| 4.4.2 重组菌株的构建及筛选 | 第53-54页 |
| 4.4.3 高表达菌株(SMD1168/pPIC9K-F3)表达的抗菌肽(Fowlicidin-1)抑菌活性与效价检测 | 第54-55页 |
| 4.4.4 高表达菌株(SMD1168/pPIC9K-F3)生长曲线 | 第55-56页 |
| 4.4.5 高表达菌株(SMD1168/PPIC9K-F3)质粒丢失率 | 第56-57页 |
| 4.4.6 高表达菌株(SMD1168/pPIC9K-F3)分泌表达的抗菌肽(Fowlicidin-1)热稳定性分析 | 第57页 |
| 4.4.7 高表达菌株(SMD1168/pPIC9K-F3)分泌表达的抗菌肽(Fowlicidin-1)pH耐受性分析 | 第57-58页 |
| 4.4.8 高表达菌株(SMD1168/pPIC9K-F3)分泌表达的抗菌肽(Fowlicidin-1)抗菌谱分析 | 第58-62页 |
| 4.5 讨论 | 第62-64页 |
| 第五章 结论与展望 | 第64-65页 |
| 5.1 结论 | 第64页 |
| 5.2 展望 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-69页 |
| 在学期间的研究成果 | 第69-70页 |
| 致谢 | 第70页 |
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