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血竭乳剂对糖尿病小鼠肝脏和肌肉组织中糖原合成酶激酶表达的影响
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【生物制西药论文】作者：柳春,冯晓帆,王艳杰,徐峰【摘要】 目的 检测糖尿病(Diabetes mellitus,DM)小鼠在接受中药血竭乳剂治疗后肝脏及右后肢肌肉组织匀浆中糖原含量及糖原合成酶激酶(GSK-3β)的表达。方法 将120只昆明小鼠分为6组,A组为正常对照组,B组为DM模型组,C、D、E组分别为血竭乳剂低、中、高剂量用药组,F组为盐酸二甲双胍用药组。C、D、E组小鼠分别按125、250、500 mg/(kg·d)剂量血竭乳剂灌胃,B组用等体积生理盐水灌胃,F组小鼠按100 mg/(kg·d)溶于等体积生理盐水灌胃,1次/d,连续给药7 d。结果 在给予血竭乳剂后,组织中GSK-3β蛋白表达比DM模型组下降(P<0.05)。结论 血竭乳剂能增加DM小鼠肝、肌糖原含量,降低GSK-3β表达水平。
【关键词】 血竭乳剂；糖原；糖原合成酶激酶；糖尿病；小鼠
Abstract：Objective To study the effect of Dragon’s blood on the expression of GSK-3β and the volume of hepatic glycogen and muscle glycogen in the liver and muscle of mice with DM. Method Selecting 120 mice of Kunming strain, and randomly dividing them into six groups：normal group, DM group, Dragon’s blood groups with three dosage [125, 250, 500 mg/(kg·d)] and C4H11N5·HCl group. Dragon’s blood groups were given Dragon’s blood by introgastric (ig) everyday for 7 d. C4H11N5·HCl group were given C4H11N5·HCl 1 mg/(kg·d) by introgastric (ig) everyday for 7 d. The indices were observed and recorded. Result After given Dragon’s blood, the expression of GSK-3β was decreased (P<0.05). Conclusion Dragon’s blood could increase the volume of hepatic glycogen and muscle glycogen of mice with DM, inhibit the expression of GSK-3β.
Key words：Dragon’s blood；glycogen；GSK-3β；DM；mice
血竭为棕榈科植物麒麟竭果实及树干中的树脂,原植物有百合科的龙血树属、棕榈科的黄藤属、大戟科的巴豆属和豆科的紫檀属中的10余种植物。本实验以糖尿病(DM)小鼠空腹血糖、肝脏和肌肉组织匀浆中糖原含量及糖原合成酶激酶(GSK-3β)表达为检测指标,揭示血竭乳剂降糖作用的机理。
1 实验材料
1.1 动物
健康远交系昆明小鼠120只,清洁级,辽宁中医药大学实验动物中心提供,许可证号：SCX(辽)2004-0018,雌雄各半,体重(28±4)g,鼠龄6周。
1.2 主要药物、试剂
血竭乳剂(沈阳药科大学药剂教研室,批号20060726)；盐酸二甲双胍(江苏正大天晴药业股份有限公司,批号060411)；四氧嘧啶(美国Fluka公司,批号426090/151502)；Mouse Anti-GSK-3β(北京赛驰生物科技有限公司)；即用型SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)；免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；肝、肌糖原试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号20060216)。
1.3 主要仪器
显微照像系统(C7070/B41 OLYMPUS)、ACCU-CHEX罗康全血糖仪及活力型血糖试纸,罗氏诊断产品有限公司产品；DYY-6C型电泳仪及垂直板电泳槽及转印仪,北京六一仪器厂产品；722型光栅分光光度计,上海第三分析仪器厂产品。
2 实验方法
2.1 分组
将小鼠随机分为6组,即正常对照组(A组)、DM模型组(B组)、血竭乳剂低、中、高剂量组(C、D、E组)以及盐酸二甲双胍组(F组),每组20只。分笼饲养,自由饮水,A组饲料为标准颗粒饲料,B～F组饲料为高糖、高脂饲料(按猪油30%、白砂糖10%、胆固醇3%的比例加入正常饲料中,按能量计算蛋白质、脂肪、碳水化合物所占比例分别为8.3%、59.3%、32.4%)。
2.2 造模
诱发性糖尿病动物模型。于通风(换气量10～20次/h)、安静、清洁、温度为(25±2)℃、相对湿度为50%～60%、光照时间6：00－18：00的室内,实验小鼠在代谢笼中适应性饲养1周,记录体重、饮水量及随机血糖等。B～F组将四氧嘧啶以注射用生理盐水新鲜配制成1.5%的溶液,空腹12 h后按四氧嘧啶250 mg/kg体重1次腹腔内注射。断尾采血[1]检测,24 h后出现血糖值升高,≥11.0 mmol/L,持续2 周以上,提示造模成功。自然喂养1 周,造模未成或意外死亡小鼠除外。A组空腹12 h后用生理盐水按等体积1次腹腔内注射,2周后参与对照。
2.3 给药
造模成功后,C、D、E组按125、250、500 mg/(kg·d)小鼠体重给予血竭乳剂灌胃[2],B组给予生理盐水等体积灌胃,F组按100 mg/(kg·d)溶于等体积生理盐水中灌胃。1次/d,连续给药7 d。
2.4 体重、空腹血糖及肝、肌糖原检测
定期称量小鼠体重；断尾取血[1]测量空腹血糖；肝、肌糖原检测方法按试剂盒说明操作。
2.5 取材方法
各组于用药7 d后按雌雄随机取10只,禁食4 h,不禁水,断头处死。沿腹白线正中切开皮肤,用镊子夹住门静脉的根部,用预冷剪刀切断血管和韧带,迅速摘取肝脏,剥离右后肢肌肉,分别用冷生理盐水冲洗2次后滤纸吸干,速冻于液氮中保存,然后转入-70 ℃冰箱待检。
2.6 Western Blot法[2]检测GSK-3β蛋白表达
2.6.1 主要试剂
SDS-PAGE试剂。匀浆缓冲液：1.0 mol/L Tris-HCl(pH 6.8)1.O mL,10%SDS 6.0 mL,β-巯基乙醇0.2 mL,ddH2O 2.8 mL。转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g,Tris 5.8 g,SDS0.37 g,甲醇200 mL,加ddH2O定容至1 000 mL。0.01 mol/L PBS(pH 7.4)：NaCl 8.0 g,KCl 0.2 g,Na2HPO4 1.44 g,KH2PO4 0.24 g,加ddH2O至1 000 mL。膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g,甲醇80 mL,乙酸2 mL,ddH2O 118 mL。包被液(5%脱脂奶粉,现配)：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 mL的0.01 mol/L PBS中。显色液：DAB 6.0 mg,0.01 mol/L PBS 10.0 mL,硫酸镍胺0.1 mL,H202 1.0 μL。
2.6.2 操作步骤
取0.5 g组织于EP管内裂解细胞并剪碎,机械匀浆1 min。然后4 ℃、11 000 r/min, 离心15 min。取上清液400 μL作为样品待检。制备电泳凝胶,进行SDS-PAGE。转移：用转膜缓冲液平衡,5 min×3次。膜处理：浸入转膜缓冲液中10 min。转膜1.5 h。转移结束后,将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色,放入膜染色液中50 s,在50%甲醇中多次脱色,至背景清晰,然后用双蒸水洗,风干保存,留与显色结果作对比。免疫反应：用0.01 mol/L PBS洗膜,5 min ×3次。加入包被液,平稳摇动,室温2 h。弃包被液,用0.01 mol/L PBS洗膜,5 min×3次。加入用0.01 mol/L PBS稀释的一抗,4 ℃ 放置12 h以上。阴性对照,以1% BSA取代一抗,其余步骤与实验组相同。弃一抗和1% BSA,用0.01 mol/L PBS分别洗膜,5 min×4次。加入用0.01 mol/L PBS稀释的辣根过氧化物酶偶联的二抗,平稳摇动,室温2 h。弃二抗,用0.01 mol/L PBS洗膜,5 min×4次。加入显色液,避光显色至出现条带时放入ddH2O中终止反应。
2.7 免疫组化方法测GSK-3β蛋白表达
2.7.1 主要试剂
0.02 mol/L PBS(pH 7.6)：1 000 mL ddH2O中加NaCl 8.5ｇ,Na2HPO4(无水)2.8 g,NaH2PO4(无水)0.4 g；0.01 mol/L枸椽酸盐缓冲液(pH 6.0)：1 000 mL ddH2O中加枸椽酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)3 g,枸椽酸(C6H8O7·H20)0.4 g。
2.7.2 操作步骤
先将小鼠肝脏组织用15%甲醛溶液固定。脱水：依次用70%乙醇溶液浸12 h；80%乙醇溶液浸12 h；90%乙醇溶液浸12 h； 95%乙醇溶液浸12 h；无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各浸15 min；二甲苯浸8 min。浸蜡：于58～62 ℃石蜡中浸3 h,包埋。载玻片防脱片剂处理：粘片剂APES(博士德公司)。捞片后置烤箱(60 ℃)60 min以使切片紧密粘附。切片(7 μm),64 ℃烤箱中烘干2 h。脱蜡：依次二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸10 min；无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各浸10 min；95%乙醇溶液浸5 min；90%乙醇溶液浸5 min；80%乙醇溶液浸3 min；ddH2O洗2次。30%H2O2 1份加ddH2O 10份混合,室温10 min以灭活内源性酶。ddH2O洗3次。热修复抗原：将切片浸入0.01 mol/L枸椽酸盐缓冲液(pH 6.0),微波炉加热至沸腾后断电,间隔10 min后,反复2次。冷却后PBS(pH 7.6)洗涤2次。滴加5%BSA封闭液,室温30 ℃。甩去多余液体,不洗。滴加1∶500稀释后的Mouse Anti-GSK-3β,4 ℃过夜。PBS(pH 7.6)洗2 min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG,37 ℃ 30 min。PBS(pH 7.6)洗2 min(3次)。滴加试剂SABC,37 ℃ 30 min。PBS(pH 7.6)洗5 min(4次)。DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1 mL ddH2O,加试剂盒中A、B试剂各1 d,混匀后加至切片。室温显色,镜下控制反应时间(5～30 min)。ddH2O洗涤。苏木素轻度复染。脱水,透明,封片。显微镜观察。
2.8 统计学方法
实验数据以x±s表示。用t检验来判断组间显著性检验,用统计软件SPSS10.0进行统计分析。
3 结果
(见表1～表3)表1 血竭乳剂对小鼠体重、空腹血糖及肝、肌糖原含量的影响(略)注：与A组比较,*P<0.05,**P<0.01；与B组比较,#P<0.05(下同)。表2 Western Blot法检测小鼠肝脏、肌肉组织中GSK-3β的蛋白表达(略)表3 免疫组化法检测小鼠肝脏中GSK-3β蛋白表达(略)
4 讨论
糖原是体内葡萄糖的重要储存形式。糖原合成减少或者分解增加可以引起血糖水平升高,导致DM发生。Bischof等[2]发现DM患者肝糖原合成功能降低。Western Blot和免疫组化检测结果表明,DM组小鼠肝脏、肌肉组织中GSK-3β表达明显增强,而血竭乳剂用药组则有所下降。本实验结果表明,血竭乳剂能增加DM小鼠肝、肌糖原含量,降低GSK-3β表达水平。由此推测,血竭乳剂能够通过调节GSK-3β表达起到降低血糖的作用。
【参考文献】
[1] 孙敬方,邵义祥,邹振伟,等.动物实验方法学[M].北京：人民卫生出版社,2001.478,229.
[2] 徐叔云,卞如濂,陈 修,等.药理实验方法学[M].第2版.北京：人民卫生出版社,2002.638,179.
[3] Bischof MG, Bernroider E, Krssak M, et al. Hepatic glycogen metabolism in type 1 diabetes after long-term near normoglycemia[J]. Diabetes,2002,51：49－54.
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