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NFκBp65和ICAM1在甲状腺肿瘤中的表达及相关性分析其它医学
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【中医学小论文下载】作者：余红梅 蔡俊伟 陈世清 朱大菊【摘要】 探讨NFκBp65和ICAM1在甲状腺肿瘤中的表达及相关性 分析 。 方法 ：收集武汉大学人民 医院 及十堰市太和医院病理科1999年至2004年存档蜡块40例, 均为手术切除后诊断明确的甲状腺肿瘤, 其中,男20例,女20例,年龄23～71岁(平均43.8岁)；按照WHO标准组织学分类: 乳头状腺癌(PTC)12例,滤泡性腺癌(FTC)10例,髓样癌(MTC)10例,未分化癌(UTC)8例; 按照AJCC标准临床病理分期:Ⅰ期12例, Ⅱ期10例,Ⅲ期11例,Ⅳ期7例。同时取甲状腺瘤旁组织15例及正常甲状腺组织5例作对照。患者术前均未行放疗或化疗。采用组织学及免疫组织化学SP法,分别对乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌、甲状腺瘤旁组织及正常甲状腺组织的组织学结构变化、相关NFκBp65因子和ICAM1进行了观察，利用HPIAS2000图像分析系统测定了NFκBp65和ICAM1在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果： NFvκB p65和ICAM1在乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌细胞胞浆内表达强；NFκB p65和ICAM1在甲状腺瘤旁组织中表达极弱或无表达；NFκB p65和ICAM1在正常甲状腺组织中表达极弱或无表达。经单因素方差分析，各组间的差异有显著性意义(P＜0.05 )。经q检验，乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌与甲状腺瘤旁组织、正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P＜0.01 )；甲状腺瘤旁组织与正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P＞0.05)。结论：①NFκBP65具有调控ICAM1的表达作用；②NFκBp65和ICAM1与甲状腺肿瘤的发生、 发展 有密切的联系。
【关键词】 NFκB p65 ICAM1 甲状腺肿瘤 免疫组织化学
甲状腺肿瘤作为一种较常见的内分泌肿瘤，其中大部分为良性,但约有5%为恶性,即各种甲状腺癌。由于甲状腺肿瘤起病较隐匿,生物学特性多变,故鉴别诊断困难,容易误诊。 目前 随着分子和蛋白质水平 研究 的不断进展,已发现许多与肿瘤的发生、发展、转移及预后有关的分子标志物，其中NFκB和ICAM1是近几年来研究较多的，NFκB和ICAM1不仅可以作为用于诊断甲状腺肿瘤的因子，并可以利用NFκB抑制物的研究为肿瘤的 治疗 开辟一条新路。本研究 应用 免疫组织化学方法研究了NFκB和ICAM1在甲状腺肿瘤中的表达并进行了相关性分析，探讨NFκBp65和ICAM1与甲状腺肿瘤的发生、发展的联系。
1 材料与方法
1.1 材料来源
收集武汉大学人民医院及十堰市太和医院病理科1999年至2004年存档蜡块40例, 均为手术切除后诊断明确的甲状腺肿瘤。其中,男20例,女20例,年龄23～71岁(平均43.8岁)；按照WHO标准组织学分类: 乳头状腺癌(PTC)12例,滤泡性腺癌(FTC)10例,髓样癌(MTC)10例,未分化癌(UTC)8例；按照AJCC标准临床病理分期:Ⅰ期12例, Ⅱ期10例,Ⅲ期11例,Ⅳ期7例。同时取甲状腺瘤旁组织15例及正常甲状腺组织5例作对照。患者术前均未行放疗或化疗。
1.2 主要试剂和仪器
1.2.1 主要试剂
浓缩型鼠抗人NFκBp65单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）；浓缩型鼠抗人ICAM1单克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）；超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新公司）；DAB显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。
1.3 实验方法
1.3.1 常规HE染色
实验标本经常规石蜡包埋、切片、HE染色。
1.3.2 免疫组织化学染色SP法检测
NFκBp65和ICAM1抗原，具体步骤如下：
① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；
② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；
③ NFκB、ICAM1采用微波抗原修复（3档，10min），PBS洗4×5min；
④ 正常羊血清37℃孵育10min以减少非特异性反应；
⑤ 一抗(NFκB，1: 200；ICAM1，1:150 )37℃孵育1h，PBS洗4×5min；
⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10min，PBS洗4×5min；
⑦ 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37℃孵育10min，PBS洗4×5min；
⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；
⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。
用PBS代替一抗作为阴性对照组。
1.4 免疫组织化学结果判断
① NFκBp65以胞核和胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，ICAM1以胞膜和胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。② 采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对NFκBp65和ICAM1的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积， 计算 阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。
1.5 统计学处理
对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和q 检验，检验水准α为0.05。
2 结果
2.1 NFκBp65的表达
乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌细胞胞浆内有较多棕黄色颗粒，NFκBp65表达强；甲状腺瘤旁组织细胞胞浆内有少许或无棕黄色颗粒沉积， NFκBp65表达极弱或无表达；正常甲状腺组织细胞胞浆内有少许或无棕黄色颗粒沉积，NFκBp65表达极弱或无表达。经单因素方差 分析 ，各组间的差异有显著性意义(P＜0.05 )。经q检验，乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌与甲状腺瘤旁组织、正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P＜0.01) ；甲状腺瘤旁组织与正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P＞0.05)。见表1。表1 甲状腺癌、甲状腺瘤旁组织及正常甲状腺组织NFκBp65表达的平均光密度和阳性面积率(略)注：* 乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌与瘤旁组织比较，P<0.01；# 正常甲状腺组织与乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌比较，P<0.01；** 瘤旁组织与正常甲状腺组织比较，P＞0.05。
2.2 ICAM1的表达
乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌细胞胞膜和胞浆内有较多棕黄色颗粒，ICAM1表达强；甲状腺瘤旁组织细胞胞膜和胞浆内有少许或无棕黄色颗粒沉积，ICAM1表达极弱或无表达；正常甲状腺组织细胞胞膜和胞浆内有少许或无棕黄色颗粒沉积，ICAM1表达极弱或无表达。经单因素方差分析，各组间的差异有显著性意义(P＜0.05 ）。经q 检验，乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌与甲状腺瘤旁组织、正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P＜0.01） ；甲状腺瘤旁组织与正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P＞0.05)。见表2。表2 甲状腺癌、甲状腺瘤旁组织及正常甲状腺组织ICAM1表达的平均光密度和阳性面积率(略)注：* 乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌与瘤旁组织比较，P<0.01；# 正常甲状腺组织与乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌比较，P<0.01；** 瘤旁组织与正常甲状腺组织比较，P＞0.05。
3 讨论
NFκB最早是1986年被Sen和Baltimore［1］提出并鉴定的一种转录因子，其命名是基于它能结合在细胞免疫球蛋白K轻链基因增强子的相应位点上。到 目前 已发现NFκB家族有5类：NFκB1（p50/p105）、NFκB2(p52/p1O0),p65(Re1A)、Re1B和CRel。NFκB的主要存在形式为p50和p65组成的二聚体，p50是与DNA结合的部位，p65参与基因转录的起始调节，并可促进p50与DNA结合。当p50与细胞质内抑制蛋白IκB结合，可掩盖p50上核定位信号，当NFκB处于p50、p65与抑制蛋白IκB结合的多聚体时，为非活化状态，IκB抑制其活性。当细胞受到TNF、IL等异常刺激时，NFκB被过度地激活，细胞的正常信号转导发生改变，某些下游基因被异常激活，导致细胞癌变。随后的 研究 发现ＮFκB在多种细胞中都有表达，并能被多种细胞外的刺激活化，参与多种基因的转录调控、与炎症反应、免疫应答、以及细胞的增生、转化和凋亡等重要的生理病理过程关系密切，是细胞激活的标志［2～5］。
已有多项研究表明，NFκB因子的持续活化可作为包括乳腺肿瘤、卵巢肿瘤、结肠癌、胰腺癌，前列腺癌以及黑色素瘤等多种实体肿瘤的标志［6，7］，Sovak等［8］在乳腺癌的研究中发现NFκB不仅高表达于未分化乳腺癌中，并且随临床分期增高、转移发生愈早，其表达越显著，提示NFκB的功能异常不仅可介导乳腺癌的发生，还可能对乳腺癌侵袭生长和转移进程施加 影响 。
我们采用免疫组织化学染色SP法检测了40例甲状腺肿瘤患者的癌组织及对照组15例甲状腺瘤旁组织与5例正常甲状腺组织中NFκBp65的表达，结果显示甲状腺乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌与甲状腺瘤旁组织、正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01) ；甲状腺瘤旁组织与正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P＞0.05)，提示NFκBp65表达与甲状腺肿瘤发病密切相关，目前认为 NFκB的致瘤机制为: ① 通过抑制细胞死亡信号的转导,保护细胞免受TNF和其它刺激因素诱导的细胞凋亡,进而对凋亡信息产生抗性［9］; ② NFκB可上调细胞周期素D1(cyclinD1)表达,促进细胞周期G1/G0期向S期转化,引发细胞无限增殖［10］。我们认为NFκBp65可以作为甲状腺肿瘤的一种分子标志物，为临床诊断提供依据。
ICAM1为免疫球蛋白家族成员之一，是一种细胞表面单链糖蛋白，在细胞膜上分细胞外段、跨膜区段和短的细胞内区段。细胞外段含有5个椭圆体，以非成对形式存在的同源结构区、是淋巴细胞功能相关抗原1（LFA1）的配体。ICAM1的分子量为80～115ku，基因位于19号染色体，ICAM1分布在内皮细胞、纤维母细胞、肾上皮细胞等，是参与介导细胞间粘附、识别的重要粘附分子［11］。ICAM1（CD54）广泛表达于单核细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞、人体癌细胞表面,能通过与其配体β2整合素LFA1（淋巴细胞功能相关抗原，CD11a/CD18）和Mac1（巨噬细胞1，CD11b/CD18）的结合而促进T细胞活化及白细胞从血管内向炎症部位浸润，在炎症和免疫反应中起重要作用。同时ICAM1在肿瘤浸润转移中的作用也引起了研究人员的重视，ICAM1表达于淋巴管、血管内皮细胞和白细胞表面，可与其他细胞表面的淋巴细胞功能相关抗原(1FA)结合，使这些细胞与内皮细胞等稳定黏附，当肿瘤细胞发生浸润、转移时，淋巴细胞和白细胞分泌如IL1、TNF等细胞因子杀灭癌细胞，同时也激活了淋巴管、血管内皮细胞内NFκB，而内皮细胞存在NFκB激活ICAM1启动子的部位，NFκB的过度活化可使内皮细胞ICAM1活化增加，进入血液或淋巴结的癌细胞与淋巴细胞竞争性地与内皮细胞结合［12］，使癌细胞能在淋巴结或其他脏器中黏附、生长、增殖。另一方面，ICAM1的过度活化可促使过多可溶性ICAM1进入血液，竞争性结合白细胞表面的受体，抑制了血液循环中ICAM1/LFA依赖的主要组织相容性复合物1（MHC1）类抗原对游离癌细胞的免疫识别作用，从而使癌细胞逃避免疫监视，更容易发生侵袭和转移［13］。另外，癌细胞内活化的NFκB还可诱导IL6和尿激酶纤溶酶原激活物，调控其周围的成纤维母细胞基质产生血管生成因子(VEGF)和细胞外基质降解酶，促进肿瘤细胞的浸润和转移［14］。
我们用免疫组织化学染色SP法同时检测了40例甲状腺肿瘤患者的癌组织及对照组15例甲状腺瘤旁组织与5例正常甲状腺组织中ICAM1的表达。研究结果显示40例甲状腺癌患者的癌组织中，乳头状腺癌、滤泡性腺癌、髓样癌、未分化癌与甲状腺瘤旁组织、正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01) ；甲状腺瘤旁组织与正常甲状腺组织之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P＞0.05)，提示在NFκB高表达的甲状腺癌组织中ICAM1同样也呈高表达。我们认为ICAM1的表达可以作为甲状腺肿瘤良恶性判别的一个有效指标，与甲状腺肿瘤的浸润和转移有关。但也有观点认为,癌组织高表达ICAM1可能是机体抗肿瘤免疫增强的反应,ICAM1通过与LFA1、Mac1相互结合吸引更多的免疫效应细胞在病灶部位聚集,发挥机体免疫系统的抗肿瘤作用,具有机体抗肿瘤免疫监视的功能，其确切机制尚待进一步研究。
【 参考 文献 】
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