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龙眼参黄酮抗心肌缺血再灌注引起的脂质过氧化损伤的研究
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【药学自我鉴定范文】作者：张绪东，蒋伟哲，焦阳，黄仁彬【摘要】 目的 探讨龙眼参黄酮（Longyanshen flavonoids,LF）对大鼠心肌缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion,MIR)引起的脂质过氧化损伤的影响。方法60只健康SD大鼠，随机分为假手术(Sham)组、缺血再灌注(MIR)组、生理盐水(normal saline,NS)组和3个预处理组(LF低剂量组、LF中剂量组、LF高剂量组)，各组大鼠雌、雄各半。结扎冠状动脉左前降支30min后，再灌注60min，建立MIR模型。用不同剂量LF在结扎冠状动脉左前降支前30min分别做预处理。再灌注结束后采血，测定血浆中谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)和丙二醛(MDA)的改变，测量心肌梗塞范围。结果与MIR组比较，LF预处理能明显降低血浆中AST，CK，CK-MB和MDA含量，能提高SOD，GSH-Px活性，降低心肌梗塞范围。结论LF对大鼠MIR引起的脂质过氧化损伤具有显著的保护作用。
【关键词】 龙眼参； 黄酮； 心肌缺血再灌注; 脂质过氧化损伤
Abstract:ObjectiveTo investigate the influence of Longyanshen flavonoids (LF) on lipid peroxidation injury induced by myocardial ischemia reperfusion(MIR) in Sprague Dawley (SD) rats.MethodsSixty healthy SD rats were randomly divided into sham operation(Sham) group, MIR group, normal saline(NS) group,and three pretreated groups(LF low dose group,LF medium dose group and LF high dose group),with half female and half male rats in each group. MIR model was established by ligating left anterior descending coronary artery for 30 min followed by reperfusion for 60 min in rats.Different dosages of LF were administered 30 min before ligating left anterior descending coronary artery in every pretreated group. Blood was collected at the end of reperfusion for detecting the changes of aspartate aminotransferase(AST),creatine kinase(CK),creatine kinase isoenzyme MB(CK-MB),superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxydase(GSH-Px), malondialdehyde(MDA).The myocardial infarct size was measured after reperfusion. ResultsLF preconditioning could significantly decrease the contents of AST,CK,CK-MB and MDA, and the myocardial infarct size,and increase the activities of SOD and GSH-Px.ConclusionLF has a significant protective effect against lipid peroxidation injury induced by myocardial ischemia reperfusion in rats.
Key words:Longyanshen; Flavonoids; Myocardial ischemia reperfusion; Lipid peroxidation injury
龙眼参Longyanshen，LYS原植物经考证为蝶形花科植物疏叶崖豆Millettia pulchra Kurz var-laxior(Dunn) Z.Wei的块根，是广西民间广泛应用的壮药。本课题组对龙眼参进行了大量的研究工作，发现龙眼参水提取物具有减轻心肌缺血再灌注性损伤、抗羟自由基和氧自由基等［1，2］作用，而龙眼参提取物龙眼参总黄酮是否具有抗心肌缺血再灌注引起的脂质过氧化损伤作用未见报道。现将其抗心肌缺血再灌注引起的脂质过氧化损伤作用及可能的作用机制报道如下。
1 器材与方法
1.1 动物
60只健康SD大鼠，广西医科大学实验动物中心提供，体重(230±20)g，雌雄各半。
1.2 试剂与仪器
龙眼参黄酮,广西医科大学药理教研室自行提取制备。伊文思蓝(Evan blue)和氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)购自Sigma公司。MDA，SOD，GSH-Px试剂盒购自南京建成生物工程研究所。AST，CK，CK-MB购自英国朗道（RANDOX）公司。动物呼吸机ALC-V8，上海奥尔科特生物科技有限公司产品。日本日立(HITACHI)7170生化分析仪，日本日立公司产品。TGL-16G-A高速冷冻离心机，上海安亨科学仪器厂产品。722N可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司。MS4000U生物信号定量记录分析系统，广州市龙飞达科技有限公司。
1.3 分组与给药方法
将SD大鼠随机分为6组，每组10只，雌雄各半：①假手术(Sham)组；②缺血再灌注(MIR)组；③生理盐水(NS)组：缺血前30 min经十二指肠注射生理盐水2 ml·kg-1；④LF低剂量组：缺血前30 min经十二指肠注射LF 20 mg·kg-1；⑤LF中剂量组：缺血前30 min经十二指肠注射LF 40 mg·kg-1；⑥LF高剂量组:缺血前30 min经十二指肠注射LF 80 mg·kg-1。
1.4 建立缺血再灌注模型
各组大鼠以20%乌拉坦腹腔注射麻醉（5 ml/kg体重），仰卧位固定。将银针电极插入四肢皮下，连接MS4000U生物信号定量记录分析系统，监测Ⅱ肢体导联心电图。分离气管并插管后立即正压人工呼吸(呼吸频率70次/min，潮气量50 ml/kg，吸呼比1∶2)。从左侧第3，4肋间打开胸腔。暴露心脏，剪破心包膜，在肺动脉圆锥左缘与左心耳右缘之间，平左心耳下缘2 mm处进针，进针深度1～2 mm，宽度2～3 mm,用5/0无损伤缝合线穿过心肌层，绕过冠状动脉左前降支，除假手术组不结扎外，其余组均结扎。30 min后解除结扎，再灌注60 min。以心电图ST段抬高、T波高耸作为心肌缺血的标志；以抬高的ST段下降，T波逐渐恢复确定再灌注的成功。再灌注结束后，从腹主动脉采血2 ml，离心（0～4℃，3 000 r/min，离心15 min），取上层血浆冻存备用。
1.5 心肌梗塞面积测量
再灌注结束后，将冠状动脉左前降支原位重新结扎，由主动脉逆行注入0.5 g·L-1的伊文思蓝1.5 ml，待心脏非缺血区充分染成蓝色后，摘取心脏，用冰生理盐水(4℃)将心脏清洗干净，剪去心底组织、心耳及右心室，置于-80℃冰箱速冻5 min，然后自心尖向心底平行于房室沟方向将左室切成1～1.5 mm厚的薄片。将心脏切片置于pH 7.4的10 g·L-1TTC磷酸盐缓冲液中，37℃孵育15 min。冷盐水冲洗去游离染料，10%甲醛固定。染成蓝色的区域代表非缺血区，红色区域（含白色区）代表缺血区，白色区域代表梗塞区。沿着不同颜色的边缘切下不同区域并称重，分别以心肌梗塞区重量(infarct weight，IW)、缺血区重量(weight of risk WR)占左室重量(weight of left ventricular，WLV)的百分比(IW/WLV)%、(WR/WLV)%反映心肌梗塞范围、心肌缺血范围。
1.6 血浆心肌酶测定
采用日本日立(HITACHI)7170生化分析仪检测血浆AST，CK，CK-MB水平。
1.7 血浆SOD，GSH-Px，MDA测定
按试剂盒方法测定SOD活力，GSH-Px，MDA含量。
1.8 统计学处理
实验数据采用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，采用SPSS13.0统计软件分析处理数据。
2 结果
2.1 血浆心肌酶的变化
MIR组血浆各心肌酶均明显高于Sham组(P<0.01)，MIR组与NS组比较，无显著性差异(P>0.05)，LF中剂量组、LF高剂量组血浆各心肌酶明显低于MIR组(P<0.01)。结果见表1。表1 龙眼参黄酮对MIR血浆心肌酶学的影响(略)
2.2 血浆SOD，GSH-Px ，MDA的变化
MIR组血浆MDA含量明显高于Sham组(P<0.01)，与NS组无差异(P>0.05)，明显高于LF各组(P<0.01或P<0.05)；MIR组SOD，GSH-Px活性明显低于Sham组(P<0.01)，与NS组无显著性差异(P>0.05)，明显低于LF高、中剂量组(P<0.01)。结果见表2。表2 龙眼参黄酮对MIR血浆SOD，GSH-Px，MDA的影响（略）
2.3 心肌梗塞范围的变化
从缺血区占左心室重量百分比看，各组间无显著性差异(P>0.05);从梗塞区占左心室重量百分比看，MIR组与NS组无差异(P>0.05)，LF组高、中剂量组明显低于MIR组(P<0.01或P<0.05)。结果见表3。表3 龙眼参黄酮对MIR心肌梗塞范围的影响（略）
3 讨论
心肌持续一段时间缺血后重新恢复血液灌注,心肌的结构和功能不仅没能恢复,反而加重了心肌的结构损伤和功能障碍,这种现象医学上称之为心肌缺血再灌注（myocardial ischemia reperfusion，MIR）损伤［3，4］。采用大鼠复制MIR模型被国内外学者广泛采用［5］。由于雌激素对心肌缺血有保护作用［6，7］，许多学者在研究MIR时，选择雄性动物。最近Primo Kuhar等［8］报道，雄激素同样对心肌缺血有保护作用，所以本实验研究选择SD大鼠雌雄各半。
正常生理情况下，细胞内有自由基清除剂超氧化物歧化酶(SOD)使氧自由基转变为过氧化氢(H2O2)，后者又通过过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的作用还原为水和分子氧,自由基产生与清除保持着动态平衡。急性心肌缺血和复灌时，由于组织缺氧、呼吸链抑制、NADH(还原型辅酶I)堆积、儿茶酚胺增多和游离脂肪酸堆积，使得膜脂质的分子氧不能全部还原，经加氧酶系产生大量自由基;自由基氧化膜上的不饱和脂肪酸，使脂肪变性形成过氧化脂质。在形成过氧化脂质过程中，过氧化又可产生自由基，引起大量氧自由基产生［9～11］。
氧自由基(OFR)生成增多，而清除OFR的酶类SOD,GSH-Px等活性降低，造成脂质过氧化物损伤、细胞内钙超载等，使膜的结构和功能遭到破坏是缺血再灌注损伤的主要机制之一［12，13］。
当心肌细胞受损伤时，AST，CK等可漏出到血液中，检测血浆心肌酶，尤其是心肌同工酶如CK-MB等可以反映心肌受损程度。MDA是自由基引发的脂质过氧化终末代谢产物，因此测定MDA值能反映氧自由基的含量和脂质过氧化程度。SOD，GSH-Px是体内清除氧自由基抗氧化酶系统的成员，检测SOD，GSH-Px活性能反映机体内抗脂质过氧化的能力［14，15］。因此，我们针对脂质过氧化损伤的环节，研究龙眼参黄酮对心肌缺血再灌注的保护作用是可行的。
本实验研究发现，与Sham组比较，MIR组血浆各心肌酶、MDA含量明显升高(P<0.01)，SOD，GSH-Px活性明显低于Sham组(P<0.01)，(IW/WLV)%增高，各组的(WR/WLV)%无差异(P>0.05), 表明结扎冠状动脉左前降支的位置基本一致，造模成功；与MIR组比较，LF中剂量组、LF高剂量组可以明显降低MDA含量(P<0.01)、升高SOD、GSH-Px活性(P<0.01)、减少心肌酶漏出(P<0.01)，降低梗塞范围(P<0.01或P<0.05)。结合以往的研究［1，2］，提示LF对实验性心肌缺血再灌注具有保护作用，其机制可能与清除氧自由基，保护氧自由基清除酶活性，减少心肌酶释放，抗脂质过氧化，减轻脂质过氧化所致心肌细胞膜的损伤等有关。
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