摘要 | 第6-8页 |
Abstract | 第8-9页 |
前言 | 第10-14页 |
材料方法 | 第14-26页 |
1. 实验材料 | 第14-16页 |
1.1 实验动物 | 第14页 |
1.2 细胞 | 第14页 |
1.3 病原体 | 第14页 |
1.4 主要试剂 | 第14-16页 |
1.5 仪器设备 | 第16页 |
2. 实验方法 | 第16-26页 |
2.1 载体构建 | 第16-18页 |
2.2 小鼠原代腹腔巨噬细胞分离培养 | 第18页 |
2.3 小鼠腹腔巨噬细胞siRNA干扰,病毒感染及干扰素刺激 | 第18-19页 |
2.4 高内涵扫描筛选 | 第19页 |
2.5 病毒滴度测定 | 第19页 |
2.6 RNA抽提,反转录及荧光定量PCR(q-PCR) | 第19-20页 |
2.7 双荧光素酶报告基因检测 | 第20页 |
2.8 流式细胞分析 | 第20-21页 |
2.9 免疫印迹,免疫沉淀 | 第21-22页 |
2.10 SILAC赖氨酸泛素化修饰水平定量质谱 | 第22页 |
2.11 ELISA | 第22-23页 |
2.12 体外蛋白纯化,GST pull down | 第23页 |
2.13 免疫荧光 | 第23-24页 |
2.14 染色质免疫共沉淀 | 第24页 |
2.15 细胞核组分分离 | 第24-25页 |
2.16 DNA pull down | 第25页 |
2.17 数据统计分析 | 第25-26页 |
实验结果 | 第26-56页 |
第一部分 RING E3调控Ⅰ型干扰素抗病毒天然免疫反应的功能筛选 | 第26-32页 |
1. 调控抗病毒反应的RING E3s筛选 | 第26-27页 |
2. 负向调控IFN-Ⅰ抗病毒天然免疫反应的RING E3s筛选 | 第27-28页 |
3. 以RNF2为例对筛选结果进行验证 | 第28-32页 |
3.1 RNF2负向调控抗病毒天然免疫反应 | 第28-29页 |
3.2 RNF2负向调控VSV感染诱导的ISGs的表达 | 第29-30页 |
3.3 RNF2负向调控IFN-Ⅰ刺激诱导的ISGs的表达 | 第30-31页 |
3.4 RNF2对VSV诱导的ISGs表达的负向调控依赖于IFNAR | 第31-32页 |
第二部分 RNF2在Ⅰ型干扰素抗病毒天然免疫反应中的调控功能 | 第32-39页 |
1. RNF2在抗病毒天然免疫反应中的体外功能 | 第32-35页 |
1.1 缺失RNF2显著增强细胞抗病毒能力 | 第32页 |
1.2 缺失RNF2显著上调抗病毒效应基因ISGs表达 | 第32-33页 |
1.3 缺失RNF2显著上调IFN-Ⅰ诱导的ISGs表达 | 第33-34页 |
1.4 过表达RNF2显著下调IFN-Ⅰ诱导的ISGs表达 | 第34-35页 |
2. RNF2在抗病毒天然免疫反应中的体内功能 | 第35-39页 |
2.1 缺失RNF2不影响脾脏中天然免疫细胞的比例 | 第35-36页 |
2.2 Rnf2~(+/-)小鼠对病毒致死的抵抗力增强 | 第36-37页 |
2.3 缺失RNF2减少小鼠体内的病毒复制及组织损伤 | 第37页 |
2.4 缺失RNF2增强小鼠体内的IFN-Ⅰ信号及下游ISGs表达 | 第37-39页 |
第三部分 RNF2负向调控Ⅰ型干扰素抗病毒天然免疫反应的机制 | 第39-56页 |
1. 寻找RNF2在抗病毒天然免疫反应中的作用底物 | 第39-42页 |
1.1 RNF2相互作用蛋白质谱及底物赖氨酸泛素化修饰水平定量质谱 | 第39-40页 |
1.2 RNF2与STAT1相互作用 | 第40-41页 |
1.3 RNF2泛素化修饰STAT1 | 第41-42页 |
2. RNF2泛素化修饰STAT1的机制 | 第42-47页 |
2.1 RNF2通过RING结构域与STAT1的DNA结合结构域相互作用 | 第42-43页 |
2.2 RNF2通过RING结构域介导STAT1发生多聚泛素化修饰 | 第43-44页 |
2.3 RNF2对IFN-Ⅰ信号通路的调控依赖其E3泛素连接酶活性 | 第44-45页 |
2.4 RNF2通过RING结构域介导STAT1发生K33位连接的多聚泛素化修饰 | 第45-47页 |
3. RNF2对IFN-Ⅰ信号通路的调控作用机制 | 第47-52页 |
3.1 RNF2不影响STAT1的激活及入核 | 第47页 |
3.2 RNF2下调STAT1酪氨酸磷酸化水平 | 第47-48页 |
3.3 RNF2参与调控STAT1酪氨酸去磷酸化 | 第48-49页 |
3.4 RNF2降低STAT1与DNA结合水平 | 第49-50页 |
3.5 RNF2促进STAT1与DNA解离 | 第50-52页 |
4. RNF2对STAT1泛素化修饰的功能及机制 | 第52-56页 |
4.1 RNF2修饰调控STAT1功能的作用位点筛选 | 第52-53页 |
4.2 RNF2对STAT1 K379的泛素化修饰负向调控STAT1介导的抗病毒反应 | 第53-54页 |
4.3 RNF2对STAT1 K379的泛素化修饰促进STAT1与DNA解离 | 第54-56页 |
讨论 | 第56-61页 |
结论 | 第61-62页 |
参考文献 | 第62-69页 |
缩略词表 | 第69-71页 |
文献综述一 | 第71-78页 |
参考文献 | 第75-78页 |
文献综述二 | 第78-88页 |
参考文献 | 第83-88页 |
个人简历及在读期间发表论文情况 | 第88-89页 |
致谢 | 第89-91页 |