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当前位置:教育论文中心首页--硕士论文--体外分子进化提高甲基对硫磷水解酶的催化活力
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体外分子进化提高甲基对硫磷水解酶的催化活力
 
     论文目录
 
摘要第3-4页
Abstract第4页
第一章 绪论第8-16页
    1.1 有机磷农药的简介第8-10页
        1.1.1 有机磷农药的分类和化学结构第8-9页
        1.1.2 有机磷农药的毒性第9页
        1.1.3 有机磷农药的环境污染和残留问题第9-10页
    1.2 有机磷降解酶的研究概况第10-12页
        1.2.1 有机磷农药降解微生物的分离第10页
        1.2.2 有机磷水解酶的分类第10-11页
        1.2.3 有机磷水解酶的空间结构第11页
        1.2.4 有机磷水解酶的催化机制第11-12页
    1.3 甲基对硫磷水解酶的研究概况第12-13页
        1.3.1 甲基对硫磷水解酶来源与序列同源性第12页
        1.3.2 甲基对硫磷降解酶的结构第12-13页
    1.4 有机磷水解酶的分子改造研究第13-14页
        1.4.1 催化效率的改造第13页
        1.4.2 热稳定性的改造第13-14页
        1.4.3 拓展底物谱的改造第14页
    1.5 论文的立题依据和主要研究内容第14-16页
        1.5.1 立题依据第14-15页
        1.5.2 主要研究内容第15-16页
第二章 材料与方法第16-26页
    2.1 实验菌株与质粒第16页
    2.2 实验设备与工具第16-17页
        2.2.1 仪器设备第16-17页
        2.2.2 实验试剂第17页
    2.3 培养基和实验溶液第17-18页
    2.4 分析软件及数据库网站第18页
    2.5 实验方法第18-26页
        2.5.1 重组质粒的提取第18-19页
        2.5.2 引物设计与mpd基因的PCR扩增第19页
        2.5.3 mpd基因片段和pET-28a载体的连接第19-20页
        2.5.4 大肠杆菌DH5α(JM109)和BL21(DE3)感受态的制备及转化第20页
        2.5.5 随机突变文库的构建第20-21页
        2.5.6 甲基对硫磷水解酶的定点突变及定点饱和突变第21页
        2.5.7 随机突变及定点饱和突变库的筛选第21-22页
        2.5.8 野生型及进化突变体的表达第22-23页
        2.5.9 野生型及进化突变体的分离纯化第23页
        2.5.10 SDS-PAGE检测第23页
        2.5.11 蛋白浓度的测定第23页
        2.5.12 甲基对硫磷水解酶酶活力的测定第23-24页
        2.5.13 甲基对硫磷水解酶动力学参数测定第24页
        2.5.14 甲基对硫磷水解酶野生型和突变体最适反应温度和热稳定性的测定第24页
        2.5.15 突变位点的生物信息学分析及突变体的结构建模第24-26页
第三章 结果与讨论第26-54页
    3.1 MPH在大肠杆菌中的异源表达及酶学性质测定第26-33页
        3.1.1 MPH在大肠杆菌中的诱导表达第26页
        3.1.2 MPH的分离纯化第26-27页
        3.1.3 MPH的酶学性质研究第27-29页
        3.1.4 最适反应pH及pH稳定性第29-30页
        3.1.5 MPH的酶活力及动力学参数测定第30-32页
        3.1.6 金属离子对甲基对硫磷水解酶活力的影响第32页
        3.1.7 有机溶剂对甲基对硫磷水解酶活力的影响第32-33页
    3.2 随机突变定向改造甲基对硫磷水解酶第33-39页
        3.2.1 易错PCR扩增mpd基因第33页
        3.2.2 易错突变库的构建第33-34页
        3.2.3 随机突变库的筛选第34-35页
        3.2.4 突变位点的结构分析第35-37页
        3.2.5 突变位点的生物信息学分析第37-38页
        3.2.6 突变体的圆二色谱分析第38-39页
    3.3 基于随机突变复合突变体的拆分及再组合第39-44页
        3.3.1 单点突变体,两位点突变体和三位点突变体的表达与蛋白纯化第39-40页
        3.3.2 单点突变体的酶学特征第40-41页
        3.3.3 双点突变体的酶学特征第41-42页
        3.3.4 三点突变体的酶学特征第42-43页
        3.3.5 关键位点的确认第43-44页
    3.4 关键氨基酸位点的改造及功能性分析第44-49页
        3.4.1 位点277饱和突变库的构建第44-45页
        3.4.2 位点277饱和突变库的筛选第45页
        3.4.3 最优正向突变体对乙基对硫磷的催化第45-46页
        3.4.4 最优突变体最适温度及热稳定性分析第46-47页
        3.4.5 最优突变体的圆二色谱分析第47-48页
        3.4.6 位点277相关loop构象的结构建模第48-49页
    3.5 活性口袋中心周围和通道处热点氨基酸的突变体的构建和功能研究第49-54页
        3.5.1 突变位点的选择第49-50页
        3.5.2 三个突变位点饱和突变库的构建及初筛第50-51页
        3.5.3 三个突变位点纯化及复筛第51-52页
        3.5.4 正向突变体最适温度及热稳定性分析第52-54页
主要结论与展望第54-55页
致谢第55-56页
参考文献第56-61页
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文第61页

 
 
论文编号BS3855227,这篇论文共61
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