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伊枯草菌素研究的文献综述
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【畜牧论文】摘 要：伊枯草菌素（iturin）是由枯草芽孢杆菌产生的一种具有环脂肽结构的两亲化合物，其中伊枯草菌素A应用最为广泛。它具有溶血、表面活性和强烈的抗真菌特性，并且具有抗菌谱广、低毒、低残留和低过敏性的特点，其抗菌机制是同时作用于病原菌的细胞壁和细胞膜，是一
摘 要：伊枯草菌素（iturin）是由枯草芽孢杆菌产生的一种具有环脂肽结构的两亲化合物，其中伊枯草菌素A应用最为广泛。它具有溶血、表面活性和强烈的抗真菌特性，并且具有抗菌谱广、低毒、低残留和低过敏性的特点，其抗菌机制是同时作用于病原菌的细胞壁和细胞膜，是一种潜在的具有极大开发应用价值的生物农药。该文综述了伊枯草菌素的应用、作用机理及发酵研究方面的进展。
关键词：伊枯草菌素；生物农药；抗真菌
中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）24-23-04
Research Progress of Iturin
Fu Wen1 et al.
（1Basic Medical College，Chengdu University of Tranditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China）
Abstract：Iturin produced by Bacillus subtilis has cyclic lipoheptapeptides linked by a β-amino acid residue. Iturin A has been used mostly. It has hematolysis activity，strong antibiotic activity and moderate surfactant activity. Previous studies have shown that iturin could be used as a fungicide against various crop diseases. Iturin A poses little risk to the environment because of its low levels of toxicity and lack of allergic effects on the host. The mechanism of its antibiotic activity is the destruction of cell membrane and cell wall. It is a biopesticide with the great development and application value. This paper summarized the progress of iturin in application，the mechanism of antibiotic activity and fermentation.
Key words：Iturin；Biopesticide；Antibiotic activity
我国是农业有害生物灾害发生较为严重的国家，而在有害生物所造成的损失中有80%是由植物病原真菌引起的。据联合国粮农组织调查，如果不使用农药，全世界粮食总收成的50%左右将会被各种病、虫、草、鼠害所吞噬。但是自20世纪以来，化学农药的大量应用所带来的食品安全和环境污染问题已十分严重，特别是绝大多数化学农药难以降解，残留期长，容易在食物链中积累，严重影响人类健康和生命安全[1]。伴随着人们环保意识的增强以及可持续发展观点的提出，生物农药开始得到重视，并逐渐成为研究和应用的热点。
伊枯草菌素（iturin）是由枯草芽孢杆菌产生的一种具有环脂肽结构的两亲化合物，疏水部分是β-氨基脂肪酸，由14～17个碳原子组成，亲水部分为肽链，是7个α-氨基酸通过由脂肪酸的氨基与C-末端氨基酸的羧基形成的酰胺键成环[2]。伊枯草菌素家族（iturin lipopeptide family）包括伊枯草菌素A、杆菌抗霉素（Bacillomycin）L、D、F，抗霉枯草菌素（Mycosubtilin）和Bacilopeptins。所有的枯草芽孢杆菌都能够产生伊枯草菌素。伊枯草菌素A是伊枯草家族中应用最为广泛的一种，它具有溶血，表面活性和强烈的抗真菌特性，并且具有抗菌谱广，低毒，过敏反应小的特点，是一种具有巨大应用潜力的抗真菌制剂，目前已被广泛地应用于医药、多种农作物病害防治及果蔬保鲜等方面[3]。
1 伊枯草菌素的应用
1.1 生物防治方面 伊枯草菌素具有广谱抑制植物病原真菌的作用，对大部分的植物致病真菌都有很好的拮抗作用，而且它具有低毒的特点，因此伊枯草菌素可作为降低化学农药利用率的一种潜在的生物农药。S.Mizumoto[4]等将含有伊枯草菌素A的发酵液用于防治灰葡萄孢霉引起的番茄猝倒病，实验结果表明，含有伊枯草菌素A的培养物能够显著地抑制番茄猝倒，而仅加入产生菌的对照并不能明显抑制疾病的发生。该实验结果说明纯粹利用伊枯草菌素A产生菌进行生物防治的效果不如含有伊枯草菌素A的发酵液，同时研究还发现伊枯草菌素A喷施在土壤中还能有效地防止种子被病原菌杀死，而且在喷施了伊枯草菌素A 17d后土壤中已经检测不到它的存在，这相比于化学农药的高残留而言，无疑更具有优越性。而且即使施药之后经过比较长时间菌体在土壤中已经死亡，但是芽孢依然可以存活60d左右，当芽孢再萌发形成营养细胞时，又可以具有一定的生防功能，因此伊枯草菌素A作为生物农药不仅没有残留而且药效持久。此外，有研究表明伊枯草菌素对玉米叶枯病也有较好的防治作用[4]。在国内已有将枯草芽孢杆菌脂肽类物质作为生物农药，防治水稻、小麦、辣椒、番茄、黄瓜等常见植物真菌病害，以及蚜虫等虫害的报道，并且研究还发现脂肽类生物农药能促进辣椒和黄瓜的生长，同时还能够提高辣椒叶绿素的含量[5]。
1.2 采后真菌病害防治方面 M.Ongena[6]等将一株枯草芽孢杆菌应用于苹果采后的真菌防治，研究发现该菌能够同时产生伊枯草菌素，fengycin（丰原素）和surfactin（表面活性素），而且无论是将该菌体还是其发酵上清液用于病原菌的防治，均能很好的降低疾病的发生。Arrebola等[7]证明伊枯草菌素还能够有效地防治鳄梨、芒果等热带水果的真菌病害。王伟[8]等还将枯草芽孢杆菌用于葡萄灰霉菌的生物防治。齐东梅[9]等将枯草芽孢杆菌应用于苹果梨采后青霉病和黑斑病的防治，也取得了较好效果。Okigbo[10]还将枯草芽孢杆菌用于甘薯采后腐烂的防治，结果表明它能很好地防止腐烂发生。曹婷婷[11]等将枯草芽孢杆菌发酵产物捷安肽素应用于采后柑桔青绿霉菌的防治取得了较好的效果。许多实验表明伊枯草菌素和丰原素是枯草芽孢杆菌产生的最主要的抗真菌物质[12]，而表面活性素对它们的抗真菌活性具有协同作用，因此枯草芽孢杆菌的3种脂肽混合使用可能更有助于真菌病害的防治。
1.3 医疗方面 由于伊枯草菌素为两亲化合物，它除了具有表面活性作用外，还具有溶血作用，对人红血球和酵母菌原生质体均有溶解作用。它是最早发现的具有抗菌活性的抗生素之一，早在20世纪50年代，伊枯草菌素A就用于治疗人和动物的皮肤真菌病，由于它具有广谱抗真菌性、低毒以及低变态反应的特点，使其成为了一种很有价值的抗真菌药物。Bacillomycin F已在药业和工业上注册专利[13]，美国已有2个从Bacillus amyloliquefaciens中生产伊枯草菌素A用于防治霉菌病的专利。
2 伊枯草菌素作用机理
2.1 破坏病原菌的细胞膜 当它作用于病原菌时，首先插入到细胞膜内，然后自发聚
集或是与膜脂类聚集形成寡聚结构，形成离子通道导致细胞内大量离子的流失，从而起到破坏病原菌的目的。实验研究表明，当伊枯草菌素A作用于质膜时，膜的导率G从10-8Scm-2升高到10-3 Scm-2，并且脂质双分子层上结合的
集或是与膜脂类聚集形成寡聚结构，形成离子通道导致细胞内大量离子的流失，从而起到破坏病原菌的目的。实验研究表明，当伊枯草菌素A作用于质膜时，膜的导率G从10-8S·cm-2升高到10-3 S·cm-2，并且脂质双分子层上结合的伊枯草菌素越多，形成的微孔越多，导致离子的通透性越强，而且形成的离子通道并不相互作用，它们开放和关闭的转换是固定的，同时这些离子通道还表现出对阴阳离子的选择性[14]。研究还发现伊枯草菌素之间的相互作用比与膜上脂质的相互作用更强，而且伊枯草菌素可能形成一种完全相互交叉的双层膜的微囊。曹婷婷[11]等发现伊枯草菌素能够迅速引起细胞膜损伤，致使细胞通透性发生改变，细胞内物质外泄，达到抑制真菌孢子萌发、菌丝体生长的效果。
2.2 破坏病原菌的细胞壁 当伊枯草菌素作用于真菌时，可引起供试真菌呈现球形膨胀，而且随着浓度的增大和作用时间延长，球形膨胀的程度和发生频率也增加[15]。代富英[16]用同位素标记法研究发现伊枯草菌素可抑制细胞（1，3）-β-葡聚糖合成酶的活性，破坏真菌细胞壁的合成，造成真菌细胞壁组分（1，3）-β-D-葡聚糖的缺损，从而抑制病原真菌的生长。
3 伊枯草菌素发酵研究进展
3.1 固态发酵生产伊枯草菌素 首次将固态发酵（SSF）应用于伊枯草菌素发酵是在1992年，日本科学家Akihiro[17]将小麦麸皮作为发酵底物，其产量与液体发酵（SMF）相比提高了至少5倍（在相等体积下比较），不过研究者认为伊枯草菌素的产生是发生在固态物质水溶性界面，说明湿度对于产物的形成相当重要，而且在此之前伊枯草菌素A的液体发酵至少需要5d，产量才能达到最大，而利用固态发酵2d即可达到最大产量。但实验研究发现通气量和温度的控制对固态发酵产量的提高至关重要。之后伊枯草菌素的SSF发酵主要是以大豆残渣作为底物，Mizumoto等人利用响应面法优化了以大豆凝乳残渣为原料生产伊枯草菌素A的条件，使伊枯草菌素A 的产量达到5.591mg/g豆渣湿重[18]。
大量实验表明SSF发酵生产伊枯草菌素比SMF具有更大的优势[19]：一是它需要的能量比液体发酵低，因为它不需要搅拌装置，能耗低；二是它可用固态废弃物作为发酵底物，生产成本低；三是传统真菌的生产就是利用固态发酵，因此它有比较清楚的实践基础；四是对于产物提取来说，它产生的废水较少，因此只需要较少的溶液进行提取。
但固态发酵工艺目前还未能实现工业化生产，因为首先没有合适的设备用于工业化固态发酵，目前有的固态发酵设备主要有平板式，摇鼓式，包被床式，包被柱式和两相空气动力改变装置，它们都存在不能解决大规模固态发酵的热量扩散和营养，氧气传递问题，其次是没有放大的标准，最后是无法实现发酵过程的实时检测和控制。
3.2 深层液体发酵生产伊枯草菌素 关于伊枯草菌素优化发酵培养基的方法主要是金属离子和氨基酸的添加实验。Yu-Hong Wei[20]等发现当在伊枯草菌素的类似物表面活性素的发酵培养基中加入Mn2+和Fe2+时，其产量可提高至少8倍，但Fe2+的加入会导致发酵液酸化，从而使产物形成酸沉淀，因此在发酵过程中要不断调整pH值，而伊枯草菌素的发酵还未见相关报道；研究发现L-Gln和L-Pro可促进伊枯草菌素A的产生，而L-Lys和β-Ala对表面活性素产量的提高具有促进作用。许锬[21]等依据氨基酸作为肽类抗生素的合成前体，在其生产期内不仅能起抗生素合成单元的作用，还能诱导抗生素生物合成的理论，在发酵过程中添加多种氨基酸以提高产物产量，通过响应面优化实验发现，在发酵过程中添加Asn、Glu和Pro 3种氨基酸，可使产量提高28.6%。除了在基本培养基中添加特殊的金属离子和氨基酸外，近几年利用响应面法优化伊枯草发酵培养基也取得了很好的效果。赵鑫[22]等利用响应面法优化伊枯草菌素培养基，使伊枯草菌素A的产量达到52.21mg/mL，抗菌活性比之前提高了46.8%。Shih[23]等利用响应面法优化发酵培养基，使伊枯草菌素A的产量提高了180%，而单因素优化实验产量仅提高57%。
其发酵工艺技术也进行了摸索。研究表明伊枯草菌素A虽然是在对数后期产生，但发酵第一天的通气量和温度至关重要。Baek-Seok[24]等报道了关于表面活性素发酵的一种新的通气方法，即在发酵培养基中加入氧载体过氧化氢，它在发酵过程中可分解为氧气和水，同时在发酵培养基中加入植物油和硬脂酸钙，作为消泡物质和氧载体，这样不仅可以很好的抑制泡沫，还能延长产物产生时间，从而提高产量。Marlene[25]等人利用分批流加培养基的方法，使伊枯草菌素A的产量达到1.27mg/g生物干重。
泡沫分离技术已经被成功的用于许多表面活性物质的分离。Makoto[26]等利用泡沫分离手段发酵生产伊枯草菌素，他们发现其生产菌株产生的伊枯草菌素基本上都集中在发酵过程中产生的泡沫里，因此通过收集泡沫，一是起到了将产物从发酵体系中连续移走，避免了产物反馈抑制；二是起到了消除泡沫对发酵的影响。但该实验结果发现产量并没有提高反而下降了，分析原因可能：（1）产物形成需要一定量的信号肽，而这些物质与产物一起被泡沫所收集分离了；（2）菌体也随着泡沫流失，减少了发酵液中的菌量，因此该发酵工艺还有待进一步优化，而且还需要对发酵设备进行适当改进。
伊枯草菌素及其类似物如表面活性素都是由枯草芽孢杆菌产生的，在发酵后期会产生大量的芽孢，而这时产物的形成会终止，因此Mohammad等利用这种现象，在发酵后期以半致死温度热刺激含有大量芽孢的发酵液10min后再补料培养，可实现芽孢的二次萌发，使菌体再次生长代谢形成产物，这种促孢子萌发的二次发酵实验最终促进了总产量的提高[27]。
3.3 固定化技术培养生产伊枯草菌素 固定化发酵技术具有发酵稳定性好，产物提取方便等优点。Mao-Sung[28]等采用在发酵培养基中加入固相载体的固定化方法生产表面活性素的相关研究，并取得了较好的效果。分析原因一方面可能是因为载体促进了菌的生长，二是载体为菌提供了一种支撑作用，促进了菌膜的形成，因此提高了产量，该法操作简单，适于大规模培养。笔者利用固定化技术以木屑为载体并添加包埋剂海藻酸钠的方法发酵生产伊枯草菌素类环脂肽物质，可使产量比一般深层液态发酵提高46.58%[29]，该实验室在此基础之上利用Plackett-Burman Design（PBD
）设计法筛选出固定化发酵关键影响因子，再利用最陡爬坡实验（Steepest Ascent Descent，SAD）和中心组合（Central Composite Designs，CCD）设计找出关键因子的最优值最终使产量提高了41%[30-31]，同时利用中心组合
）设计法筛选出固定化发酵关键影响因子，再利用最陡爬坡实验（Steepest Ascent Descent，SAD）和中心组合（Central Composite Designs，CCD）设计找出关键因子的最优值最终使产量提高了41%[30-31]，同时利用中心组合设计法优化5L发酵罐分批补料发酵生产伊枯草菌素，使产量比单次分批发酵又提高了44%[32]，而且由于添加了固定化载体和包埋剂使发酵过程中泡沫溢出得到了较好的抑制。
3.4 浅层静态培养生产伊枯草菌素 浅层生物膜发酵是一种较新的液体发酵方法，是伊枯草菌素发酵方法革新的巨大进展[33]。其生产菌株为基因工程菌，该枯草芽孢杆菌能够在液体培养基的表面产生较厚且稳定的菌膜，在浅层静态方式下培养，菌的生长速度，产物形成速度和芽孢形成速度均慢于深层液态发酵，但是最终的总菌量与深层液态培养并没有差异。该发酵方法虽然产素周期延长，但是由于其生长代谢活性状态能够维持更长时间且提高了菌对底物的有效利用，其产量反而高于深层液态发酵。而且形成生物膜上的细胞更不易于形成孢子，因为在此体系中，氧气的传递受到一定的限制，不会使菌体的超量增长引起底物的缺乏。目前已经开展了对枯草芽孢杆菌生物膜形成的过程、特征及分子调控机制的相关研究[34]，有望进一步提高浅层液态发酵培养生产伊枯草菌素的产量。
4 展望
尽管有研究表明枯草芽孢杆菌可能涉及一些食物中毒事件，但它对人体的毒性是很低的，而且事实上它并不是人体的致病菌，目前主要实验应用的也是它的发酵产物伊枯草菌素，因此把枯草芽孢杆菌发酵产物伊枯草菌素作为抗真菌物质，不仅具有环境友好性，而且对人体也没有伤害，将其作为生物农药或抗真菌药物具有极大的开发应用前景[35]。但是相比于一些化学合成的抗真菌药物而言，伊枯草菌素并没能进行工业化生产，究其原因还是常规发酵产量较低，而高发酵产量的生产工艺复杂，生产成本过高。目前随着基因工程技术的不断提高，已经有人利用基因工程的方法将HpaGXooc，一种能够激发非寄主植物的过敏性细胞坏死，诱导植物抗病、抗虫和抗旱，同时促进植物生长的非特异性蛋白激发子的基因转化B. subtilis OKB105，并得到了基因工程菌株OKBHF，研究发现它能够更好的诱导植物抗病性和促进植物生长[5]。因此随着伊枯草菌素相关基因研究的不断深入以及枯草芽孢杆菌和寄主植物之间相互作用的分子机制的不断深入，通过分子诱变育种、生物合成结构类似物、提高产物分离效率和简化发酵工艺同时提高发酵产量等手段，最终可以达到大规模生产伊枯草菌素的目的。
参考文献
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