|
AB-8大孔吸附树脂分离小叶榕叶水提物中黄酮类化合物的研究
|
|
【药学大专毕业论文】作者：冯丹丹，王立升，刘力恒，龚福忠，李鑫【摘要】 目的考察AB-8大孔吸附树脂对小叶榕叶水提物黄酮的吸附解吸性能。方法采用树脂柱进行动态吸附和解吸小叶榕叶水提物中的黄酮类化合物，用紫外-可见分光光度法测吸光度，得出吸附率和解吸率。结果AB-8大孔吸附树脂对小叶榕叶水提物黄酮有较高的吸附率和解吸率，能达到分离纯化的目的。结论AB-8能有效富集小叶榕叶中黄酮类化合物，适用于分离纯化小叶榕叶浸膏以提高其有效成分。
【关键词】 小叶榕；黄酮；大孔吸附树脂；动态吸附；动态解吸
Abstract：ObjectiveTo study the absorption and desorption quantity of AB-8 Macroporous Resin with flavones in aqueous extracts of Ficus microcarpa L.f.MethodsUsing spectrophotometry to check absorbance of sample which dynamic absorb and desorb flavones in aqueous extracts of Ficus microcarpa L. f. by resin column to get the aborption rate and desorption rate.ResultsAB-8 Macroporous Resin which has preferable absorption and desorption capacity for flavonoids in aqueous extracts of Ficus microcarpa L.f. coud be used to purity the extracts.ConclusionAB-8 Resin has the capability of enriching flavonoids in Ficus microcarpa L.f. validitily. It is feasible to applies AB-8 Resin to raise compositions of Ficus microcarpa L.f.
Key words：Ficus microcarpa L.f.; Flavonoids; Macroporous resin ; Dynamic absorbing; Dynamic desorption
小叶榕Ficus microcarpa L.f.为桑科植物榕树，异名落地金线，是热带雨林中的关键种类。我国榕属植物约一百种，主要分布在福建、广东、广西、海南、台湾和浙江等地。研究表明小叶榕叶中主要含黄酮、三萜类、齐墩果酸、脂肪族化合物和甾体化合物等［1］。其中黄酮类等有效成分对治疗冠心病、老年性痴呆、脑血栓、神经系统疾病和消除自由基、抗炎、抑菌、抗癌等方面有显著效果，无毒副作用，并以此开发出多种药品和保健食品。已正式上市的部颁标准中哮喘和慢性支气管炎治疗药咳特灵胶囊就是以小叶榕叶浸膏作为主成分的［2～4］。
大孔吸附树脂具有物理化学稳定性高，吸附选择性强，富集效果好,解吸条件温和，再生简便，使用周期长等优点，因此，近年来，树脂吸附法得到了长足的发展，被广泛应用于天然产物的分离纯化［5～11］。郭菁等［12］考察了AB-8树脂对红花桑寄生总黄酮的饱和吸附量可达29.0 mg/g，动态洗脱率达95.0%，获得产品中黄酮纯度为46.0%，得率为5.5%。林秋凤等［13］研究了AB-8大孔吸附树脂对金莲花总黄酮的吸附和解吸特性，纯化后的总黄酮纯度为38.9%，比粗提物的总黄酮纯度提高了2.88倍，纯化能力与聚酰胺相当。目前国内外对小叶榕叶总黄酮提取分离的报道较多，但都是采用石油醚、乙醇、水等溶剂直接浸提或辅以超声波提取［14～18］，未见有使用大孔吸附树脂进行纯化的报道。本文以小叶榕叶水提物为原料液，选择对植物黄酮类化合物有较好吸附选择性的AB-8大孔吸附树脂［19～24］，通过对小叶榕叶水提物黄酮的动态吸附和动态解吸研究，发现AB-8 吸附树脂能有效提高小叶榕叶水提物浸膏的黄酮含量，是一种性能优良、价格低廉、可实现工业化生产的吸附剂。
1 材料与仪器
小叶榕叶水提物浸膏，购于广西南宁市内。标准品芦丁，南京青泽医药科技开发有限公司（批号：20060211）；其他试剂均为分析纯；AB-8大孔吸附树脂 天津南开大学化工厂。2550紫外可见分光光度计（日本岛津）；RE-52C 旋转蒸发仪；BQ50-1J/WX10恒流泵（保定兰格恒流泵有限公司）；分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司 AL204］。
2 方法
2.1 树脂的预处理［25～27］将新树脂加水浸泡24 h，用砂芯柱进行反洗，除掉小颗粒树脂。先用乙醇浸泡充分溶胀，然后用乙醇洗至流出液加适量水无白色浑浊现象，再用蒸馏水洗尽醇味，最后转入酸碱处理。即用5%HCl浸泡4 h，滤过后蒸馏水洗至近中性。再用4%NaOH浸泡4 h，滤过后蒸馏水洗至近中性。最后用含4%NaCl和4%NaCO3的混合溶液浸泡4 h，用蒸馏水反复清洗至中性，备用。
2.2 吸附树脂的物理性能树脂吸附性能的优劣是由其化学和物理结构所决定的，AB-8大孔吸附树脂的结构性能见表1。表1 吸附树脂的物理性能（略）
2.3 供试液的制备称取小叶榕叶水提取物550.1 g（含水量为35.60%）,加8 869 ml蒸馏水溶解,静置4 h以上，减压抽滤，滤液收集备用。
2.4 检测方法
［28］称取芦丁标准品20.1 mg，用60% 乙醇溶解并定容于500 ml容量瓶中, 摇匀得浓度为40.2 μg/ml的芦丁标准溶液，备用。分别精取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 ml芦丁标准溶液于8只25 ml容量瓶中，各加入0.5 mol/L NaNO2溶液1.0 ml，混匀，放置6 min后加入0.3 mol/LAlCl3溶液1.0 ml，摇匀，放置6 min，加入1 mol/L NaOH 溶液5 ml，用60%乙醇稀释至刻度，以芦丁标准品为参比，于波长500 nm处比色测定各吸光度。其结果见图1 。
数据用最小二乘法进行线性回归，得芦丁溶液Y与吸光度值X 的关系曲线的回归方程式：Y=0.010 9X+0.000 3，r=0.999 4。用同种方法，相同条件下测定各样品的吸光度，由对应的吸光度标准曲线查出相应浓度，并计算样品黄酮浓度。
2.5 AB-8大孔吸附树脂的吸附性能和解吸性能测定
2.5.1 树脂的吸附量和吸附率测定
［29］测定方法为：准确称取经预处理的树脂各10 g (湿)， 含水量均为76.67%，装入30 cm×1.5 cm玻璃柱中，控制上样流速为2.60 ml/min,柱底活塞全打开，过柱液流速与上样液流速一致，收集过柱液，重吸附1次使样品液得以与树脂充分接触，测定最后过柱液中黄酮浓度，按下式计算树脂室温下的吸附量(mg/g)。
Q=（Co-Cr）×V/W
式中：Q为吸附量(mg/g)，C0为上样液黄酮浓度(mg/ml)，Cr为过柱液黄酮浓度(mg/ml)，V 为溶液体积(ml)，W为树脂重量(g)。
按下式计算树脂室温下的吸附率（%）。
q （%）= (C0－Cr) / C0×100%
式中：q为吸附率(%)，C0为上样液黄酮浓度(mg/ml)，Cr为过柱液黄酮浓度(mg/ml)。
2.5.2 树脂的解吸率测定按“2.5.1”方法对充分吸附后的树脂，控制流速为2.60 ml/min，分别用蒸馏水冲洗至流出液清亮，再用50%乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，测定醇洗脱液中黄酮浓度，并根据吸附量计算室温下的解吸率(%)。
树脂解吸率( % )= ［ C2/ ( C0－C1) ］×100%
式中：C0为上样液黄酮浓度(mg/ml)，C1为过柱液黄酮浓度(mg/ml) C2为洗脱液黄酮浓度(mg/ml)。
2.6 AB-8大孔吸附树脂对小叶榕叶黄酮的动态吸附实验对AB-8大孔吸附树脂进行洗脱流速、上样液的pH 值、上样浓度、解吸流速、解吸液pH以及洗脱剂的浓度、用量等进行动态吸附实验，将预处理好的树脂装入1.5 cm×30 cm玻璃层析柱中，将已制备好的供试液按一定比例稀释后作为上样原液上柱，控制一定流速，分步收集过柱液，当流出液黄酮浓度达泄漏点即上样液的2/3 时，认为已透过，停止上样，计算吸附量。
吸附量= 上样液浓度(mg/ ml) ×流出液体积(ml)
3 结果
3.1 AB-8大孔吸附树脂对小叶榕叶黄酮的动态吸附结果［10，11］
3.1.1 流速的影响样品溶液通过树脂的流速对工作效率及其有效成分的吸附均有较大影响。通过调节恒流泵的流速对上柱溶液进行吸附流速的选择，应以泄漏点最迟出现的吸附流速为宜［19］。因此在样液黄酮浓度均为3.901 4 mg/ml，样液体积均为100 ml的条件下，控制流速分别为1.17，2.60，3.30，4.60，5.28 ml/min 进行动态吸附。5种吸附流速下的泄漏情况见图2 所示。
通过计算可知，若流速为1.17 ml/min 时，泄漏点出现在80 ml附近，若流速为2.60 ml/min时，泄漏点出现在55 ml附近，若流速为3.30 ml/min 时，泄漏点出现在45 ml附近，若流速为4.60 ml/min 时，泄漏点出现在30 ml附近，若流速为5.28 ml/min 时，泄漏点出现在20 ml附近。流速为1.17 ml/min 时，虽然泄漏点出现的最迟，但导致循环周期延长。另对吸附树脂而言，不仅要求其吸附性能良好，还要追求其良好的洗脱性能，单一吸附泄漏点的后移，并不代表洗脱的效果也很好，洗脱效果是决定最佳吸附条件的另一关键。综合考虑吸附效果及生产周期，建议采用上样流速为2.60 ml/min进行吸附。
3.1.2 样品液pH 值的影响提取液的pH值是影响树脂纯化效果的重要因素，其基本原理是中药有效成分在不同pH值条件下溶解性能不同，因而易于吸附或解吸。在样液浓度均为2.9477 mg/ml,样液体积均为40ml的条件下，用酸或碱将稀释后的小叶榕叶供试液调成不同的pH值2，3，4，5，6，7，在吸附流速为2.60 ml/min时，分别对其泄漏情况进行比较。结果见图3。
通过计算可知，6种条件下的泄漏点分别为30，25，20，18，16，14 ml。可见，AB-8 对供试液有较大的吸附量。从吸附量上考虑，pH=5.0 的条件下进行吸附比较适宜。这是由于黄酮类化合物为多羟基酚类，呈弱酸性，因而，要达到较好的吸附效果，必须在弱酸性条件下吸附。
3.1.3 上样浓度的影响原液浓度也是影响吸附的重要因素，如果原液浓度过低提纯时间增加，效率降低；原液浓度过高则泄漏早，处理量小，树脂的再生周期短。各取小叶榕叶水提物供试液34，50，67，83 ml，分别加水定容至100 ml容量瓶中，配成小叶榕叶水提物可溶物浓度为10，15，20，25，30 mg/ml的上样液，以乙=2.60 ml/min的流速流过玻璃层析柱，重吸附1次，收集过柱液，测定流出液黄酮浓度，计算吸附量。结果见图4。
由图4可知，随着上样液浓度的增加，树脂吸附量相应增加，考虑生产成本及最佳吸附效果，取上样浓度为15 mg/ml为宜。
3.2 AB-8大孔吸附树脂对小叶榕叶黄酮的动态解吸结果［11］
3.2.1 不同体积分数解吸剂的洗脱效果吸附层析法是根据被分离物质与树脂之间吸附力强弱来选择不同的洗脱剂和相应的洗脱剂浓度。对于极性不大的大孔树脂和被分离物来说，洗脱剂极性越小，洗脱能力就越强；对于极性较大的大孔树脂和被分离物而言，则用极性较大的溶剂较为合适。由于乙醇极性大，毒性低，易浓缩回收，较适合作为解吸剂。本试验取适量AB-8 树脂，以40 ml 吸附液进行吸附，控制吸附流速为2.60 ml/min，再分别取40 ml 10%，30%，50%，70%，95% 的乙醇溶剂进行洗脱，解吸流速控制为2.60 ml/min，收集各洗脱液，然后测定它们的吸光度值。结果见图5。
由图5 可以看出，采用体积分数50% 以上的乙醇水溶液进行解吸时具有较高的解吸率，且解吸率增幅平缓。因此，体积分数50% 以上的乙醇水溶液解吸效果较好。考虑到溶剂消耗问题，取洗脱浓度50%为宜。
3.2.2 不同用量解吸剂的洗脱效果在确定洗脱剂洗脱的最佳浓度后，还需要对洗脱剂的最佳用量进行确定，其原则是在充分洗脱下所吸附的物质的前提下，尽量节省洗脱剂的用量。以50 ml 吸附液进行吸附，控制吸附流速为2.60 ml/min，重吸附1次，待吸附完全后，再用水洗脱至流出液清亮，分别取30%，50%，70%乙醇溶剂进行洗脱，解吸流速控制为2.60 ml/min，分步收集各洗脱液，然后测定它们的吸光度值。结果见图6 。
由图6可知，当洗脱液体积从2 ml增加至10 ml时，洗脱液的黄酮浓度增加8～18倍，而洗脱液体积从10 ml增加到20 ml时,洗脱液的黄酮浓度逐步下降，从20 ml增加至40 ml，黄酮浓度基本不变，洗脱完全。可以看出，采用体积分数70%和50% 乙醇进行解吸时，洗脱峰集中，对称，无明显拖尾现象，50%乙醇洗脱峰基本与70%乙醇洗脱峰重叠，考虑到成本以及生产周期的问题，洗脱剂用量选择30 ml，浓度选择50%乙醇洗脱比较合适。
3.2.3 动态解吸速度洗脱流速与树脂的孔径、孔容、粒度、吸附物质分子结构及浓度、操作温度等因素有关，最佳流速可通过解吸率、纯度等指标确定。以40 ml 吸附液进行吸附，控制吸附流速为2.60 ml/min，重吸附1次，当吸附完全后，先用水洗脱至流出液清亮，再采用50% 乙醇进行柱上洗脱，流速分别为1.17，2.60，3.30，4.60，5.28 ml/min， 收集洗脱液，分别测定它们的吸光度值。结果见图7。
由图7可知，随着解吸速度增加，解吸率随之降低。解吸速度为1.17，2.60 ml/min时的解吸率较高，综合考虑生产周期及洗脱效果，选择解吸速度2.60 ml/min为宜。
3.2.4 不同pH值解吸液的洗脱效果洗脱剂的pH值对其洗脱能力有显著影响。通过改变洗脱剂的pH值，可使吸附物质形成较强的离子化合物，很容易被洗脱下来，从而提高洗脱率。以50 ml吸附液进行吸附，控制吸附流速为2.60 ml/min,重吸附1次，当吸附完全后，用水洗脱至流出液清亮，用酸和碱调节50%乙醇水溶液至不同pH值4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，控制解吸流速为2.60 ml/min,分别收集各洗脱液，测定它们的吸光度值。结果见图8。
由图8可知，随着洗脱剂pH值加大，洗脱液的洗脱能力增强，考虑过大的pH对黄酮类化合物后处理及部分化合物结构稳定性的影响，建议采用洗脱剂pH不超过8.0。
4 结论
AB-8 树脂对小叶榕叶的黄酮吸附量大，易解吸，是一种理想的纯化小叶榕叶有效成分的吸附剂，比较适合于对小叶榕叶黄酮类化合物的提取分离。
考虑纯化过程中的生产周期及树脂吸附性能，样品液中吸附过程中采用上样流速2.60 ml/min，上样液浓度15 mg/ml，pH=5.0时效果最好。
当用体积分数大于50%的乙醇水溶液作为洗脱剂时，能将小叶榕叶黄酮基本解吸出来，洗脱峰集中，对称性好，无明显拖尾现象，洗脱周期短，洗脱效果显著。
【参考文献】
［1］江苏新医学院.中药大辞典,下册［M］.上海：上海科技出版社,1988:2529.
［2］国家中医药局《中华本草》编委会.中华本草,第2册［M］.上海：上海科技出版社,1999:495.
［3］韦锦斌,黄仁彬,林 军,等.小叶榕水提物和醇提物止咳平喘作用的比较研究［J］.广西中医药,2006,29(4),58.
［4］刘力恒,王立升,王天文,等.小叶榕化学成分及药理活性的研究进展［J］.时珍国医国药,2008,19(2):390.
［5］杨红.中药化学实用技术［M］.北京：化学工业出版社,2004.
［6］郭丽冰,王 蕾.常用大孔吸附树脂的主要参数和应用情况［J］.中国现代中药,2006,8(4):26.
［7］龙继红.大孔吸附树脂纯化天然药物有效成分的影响因素［J］.华西药学杂志,2007,22(2):237.
［8］汪洪武,刘艳清.大孔吸附树脂的应用研究进展［J］.中药材,2005,28(4):353.
［9］周剑,丁玉峰.大孔吸附树脂分离中草药有效成分的应用［J］.中国医院药学杂志,2006,26(1):69.
［10］白夺龙,杨开华.大孔吸附树脂分离纯化技术及应用［J］.海峡药学,2007,19(9):96.
［11］周忻.大孔吸附树脂分离纯化中药有效成分的影响因素［J］.中国药物应用与监测,2006,2:50.
［12］郭菁,李婷,陈炳华,等.AB-8大孔树脂吸附分离红花桑寄生总黄酮的影响因子研究［J］.亚热带植物科学,2007,36(2):22.
［13］林秋凤,王凌云,李药兰,等.AB-8大孔吸附树脂分离长瓣金莲花总黄酮［J］.暨南大学学报（自然科学版）,2003,24(1):55.
［14］夏杏洲，张辉，魏传晚．榕树叶中黄酮类化合物的提取条件研究［J］．食品研究与开发，2002，23(5)：35．
［15］叶荣科,张德志,周宏兵,等.小叶榕树叶总黄酮水提醇沉工艺研究［J］.广东药学院学报，2003,19(4):330.
［16］黄锁义,刘海花,黎海妮,等.超声波提取榕树叶（小叶）总黄酮及鉴别［J］.时珍国医国药,2006,17(9):1737.
［17］符方非,张余霞,沈艳红,等.小叶榕提取工艺的改进［J］.药物研究,2008,5(1):25.
［18］黄涛,庞小雄,周宏兵,等.小叶榕叶水提物超频震动膜过滤工艺的研究［J］.广东药学院学报,2007,23（2）：116.
［19］张素华,王正云.大孔树脂纯化芦笋黄酮工艺的研究［J］.食品科学,2006,27(2):182.
［20］潘见,陈强,谢慧明,等.大孔树脂对葛根黄酮的吸附分离特性研究［J］.农业工程学报,1999,15(1):236.
［21］陈乃富,陈科,张莉,等.大孔树脂柱层析法纯化金樱子总黄酮的初步研究［J］.中药材,2007,30(8):1013.
［22］徐海南,杨向东,周本宏,等.大孔吸附树脂纯化射干总异黄酮的工艺考察［J］.中国医院药学杂志,2007,27(5):606.
［23］桂本,郭嘉,池汝安,等.大孔吸附树脂对葛根总黄酮吸附性能的研究［J］.应用化工,2007,36(5):451.
［24］陈寒青,金征宇.大孔吸附树脂对红车轴草异黄酮吸附分离特性的研究［J］.天然产物研究与开发,2006,18:187.
［25］周光娇,周亚球.浅析大孔吸附树脂［J］.时珍国医国药,2006,17(4):589.
［26］常增荣,张小茜.中药提取物中的大孔吸附树脂残留物限量检查研究［J］.中国中药杂志,2004,29(6):585.
［27］贾存勤,李阳春,屠鹏飞,等.D-101型大孔吸附树脂预处理方法的研究［J］.中草药,2006,37(2):193.
［28］刘力恒,王立升,冯丹丹,等.广西小叶榕叶总黄酮的提取工艺改进研究［J］.化学试剂,2008,30(7):543.
［29］曾晖.银杏叶黄酮类化合物的提取精制研究［D］.重庆大学.2006:42.
|
|
|
广告服务