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聚乳酸羟基乙酸共聚物和胶原膜对体外培养人表皮角质细胞分泌细胞因子的影响
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【医学论文集】作者：陈晓东 江琼 吴伯瑜 王顺宾【摘要】 目的 探讨聚乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）和胶原膜对表皮角质细胞分泌细胞因子的影响及其在创面修复中的可能作用机制。 方法 实验组分为PLGA组和胶原膜组，表皮角质细胞以3×107 cm-2密度分别种植于PLGA和胶原膜上；对照组为单层表皮角质细胞培养。于第7天和第14天扫描电镜下观察细胞生长状况；种植后第1，3，5，7，14天收集细胞培养上清液，检测乳酸脱氢酶（LDH）水平观察细胞损伤程度，应用ELISA法检测培养上清液中白细胞介素1β（IL1β）、白细胞介素6（IL6）和白细胞介素8（IL8）的水平。 结果 表皮角质细胞种植后第7天，扫描电镜下可见细胞粘附于PLGA和胶原膜呈原有三维结构稳定均一生长，第14天有纤维丝状细胞外基质生成。实验组和对照组各时相点LDH水平差别无统计学意义。PLGA组和胶原膜组表皮角质细胞分泌IL1β、IL6和IL8水平与对照组比较均有不同程度上升，其差别具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。 结论 PLGA和胶原膜在构建组织工程皮肤中作为一种生物支架，增强表皮角质细胞分泌IL1β、IL6和IL8能力，对加速创面愈合可能起着积极作用。
【关键词】 组织工程；聚合物； 聚乙醇酸；乳酸； 表皮； 角蛋白细胞； 胶原； 生物膜； 细胞因子类
理想的组织工程细胞外支架应具备合理的三维、多孔网络立体结构，良好的生物相容性和生物降解性，表面应适于细胞粘附及正常的分化和增殖，并具有一定的生物力学性能，可携带活性物质等[1]。因此，不同的生物材料对种子细胞增殖、分化和功能有着不同程度的影响。本研究旨在通过观察体外培养人表皮角质细胞在两种不同来源的生物支架——聚乳酸羟基乙酸共聚物（polyD,Llacticcoglycolic acid，PLGA）和胶原膜生长状况以其对表皮角质细胞分泌白细胞介素1β（IL1β）、白细胞介素6（IL6）和白细胞介素8（IL8）水平的影响，探讨其在创面修复中的可能作用机制。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 PLGA（美国Synthecon公司）；胶原膜(福建省博特生物科技有限公司)；KSFM、DMEM培养基、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；分散酶（dispaseⅡ,美国Sigma公司）；新生小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；细胞培养板(美国Costar公司);乳酸脱氢酶（LDH试剂盒,美国Beckman公司）;IL1β、IL6和IL8 试剂盒(上海华涛生物科技有限公司)。
1.1.2 仪器 二氧化碳培养箱(Forma 3111，美国Thermo公司);倒置显微镜(TS100，日本Nikon公司);全自动生化分析仪(LX20，美国Beckman公司);酶标仪(ELx800，美国DIOTAK公司);扫描电镜(JSM6380LV，日本JEOL公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 获得知情同意的情况下，皮肤组织取自小儿外科6～10岁健康儿童的包皮，无菌磷酸盐缓冲液(DPBS，含20 mg/L庆大霉素，pH 7.4）冲洗3次后切成小块，移至25 U/mL dispaseⅡ、5 mg/L庆大霉素的DPBS中，置4 ℃孵育12 h后，将表皮角质层与真皮分离，分离下表皮角质加入含0.05%胰酶0.53 mmoL/L EDTA的DPBS缓冲液10 mL，于37 ℃孵育10 min，并不断吹打，促进细胞分离；用含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，100目细胞筛子滤掉组织残渣后，离心5 min，弃上清，加入KSFM培养液制成单细胞悬液接种于培养瓶，37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养，每4 d换液1次。
1.2.2 细胞生物材料复合物的制备 实验组分为PLGA组和胶原膜组，将无菌的PLGA和胶原膜剪成1 cm×1 cm，置24孔细胞培养板内，以3×107 cm-2的密度加入表皮角质细胞，37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养4 h后，培养皿中缓慢加入KSFM培养液1 mL，继续培养至14 d，每天观察细胞在PLGA和胶原膜上的生长状况；相同条件单层表皮角质细胞培养作为对照组。
1.2.3 扫描电镜观察 取上述培养分别达7，14 d表皮角质细胞PLGA和表皮角质细胞胶原膜复合物，5%戊二醛固定4 h，PBS清洗后用1%饿酸固定4 h，蒸馏水清洗，酒精逐级脱水，环氧丙烷置换，临界点干燥后上台喷金，上机观察、拍照。
1.2.4 LDH的测定 采用全自动生化分析仪。分别于培养后第1，3，5，7，14天收集实验组和对照组细胞培养上清液（设6个复孔），置－80 ℃保存，成批检测。
1.2.5 细胞因子检测 分别于培养后第1，3，5，7，14天收集实验组和对照组细胞培养上清液（设6个复孔），置－80 ℃保存，成批检测。ELISA检测的操作步骤严格按说明书，先分别在已包被抗体（IL1β、IL6和IL8）的包被板中加入不同浓度标准品及样本100 μL，于37 ℃孵育90 min后洗板5次；加入第一抗体50 μL，37 ℃继续孵育60 min后洗板5次；再加入酶标抗体工作液100 μL，37 ℃孵育30 min后洗板5次；加入显色剂A、B各1滴，37 ℃避光显色15 min，加入终止液1滴，混匀，于全自动酶标仪450 nm处读取D值，并根据其标准曲线计算出各样本的含量。
1.3 统计学处理 数据以x±s表示，采用SPSS 11.0统计软件包处理。2组样本比较采用IndependentSamples t检验，P<0.05为差别有统计学意义。
2 结 果
2.1 电镜观察 （1）表皮角质细胞PLGA复合物的超微结构。PLGA以直径约为15 μm纤维纵横交织而成，在纤维间形成大小不等的间隙；表皮角质细胞培养7 d后，可见表皮角质细胞在PLGA呈扁平、似挂霜样包绕纤维表面生长；培养14 d后，可见细胞密度显著增多, 细胞呈平行、相互交错排列形成网状平铺于纤维间隙生长，细胞表面可见微绒毛和突起形成（图1）。（2）表皮角质细胞胶原膜复合物的超微结构。胶原膜表面结构呈较为光滑、不规则的折叠状分布，且有间隙形成；表皮角质细胞在胶原膜生长7 d后，可见细胞紧密地粘附在胶原膜上，具有良好的伸展状态且平铺于胶原膜生长；培养14 d后，可见细胞密度显著增多,细胞呈扁平状生长，细胞表面可见较多微绒毛和突起形成，各突起间相互交错排列形成网状铺于胶原膜表面且延伸进入间隙中，并有纤维丝状细胞外基质生成（图2）。
PLGA：聚乳酸羟基乙酸共聚物. A：PLGA 为纤维纵横交织(×200)；B：种植第7天表皮角质细胞挂霜式在PLGA表面生长(×1 000)；C：种植第14天表皮角质细胞呈网状平铺于纤维间隙生长,并有微绒毛和突起形成(×1 000).
2.2 PLGA和胶原膜对表皮角质细胞分泌LDH水平的影响 对照组、PLGA组和胶原膜组表皮角质细胞分泌LDH水平从第1天至第14天随细胞培养时间的延长均有不同程度升高，其中PLGA组和胶原膜组LDH水平略微高于对照组，但差别无统计学意义（图3）。
2.3 PLGA和胶原膜对表皮角质细胞分泌IL1β、IL6和IL8的影响 对照组、PLGA组和胶原膜组表皮角质细胞分泌IL1β、IL6和IL8水平从第1天至第14天随细胞培养时间延长均有不同程度升高，部分时相点差别具有统计学意义(P<0.05或0.01)；PLGA组第5天、胶原膜组第1天和第3天表皮角质细胞分泌IL1β水平显著上升，与对照组比较，差别具有统计学意义(P<0.05)；PLGA组和胶原膜组第1天至第5天以及第14天表皮角质细胞分泌IL6水平显著上升，与对照组比较差别具有统计学意义(P<0.05或0.01)；PLGA组和胶原膜组中第1，5，7天表皮角质细胞分泌IL8水平显著上升，与对照组比较差别具有统计学意义(P<0.05或0.01，表1)。
3 讨 论
目前用于组织工程的细胞外支架材料主要有两大类型：(1)合成高分子材料：无机高分子材料如生物活性玻璃、羟基磷灰石、磷酸三钙等，生物可降解高分子材料如聚酯类、聚酸酐和聚丁二烯酸异丙酯等，其中对聚羟基乙酸（PGA）、聚乳酸（PLA）以及两者的共聚物PLGA的研究较为广泛，而PLGA由于具有良好的生物相容性和可降解吸收性，成为组织工程研究中应用最多的细胞支架材料[24]；(2)表1 PLGA和胶原膜对表皮角质细胞分泌IL1β、IL6和IL8的影响
天然材料如胶原、甲壳素、纤维蛋白、透明质酸钠等，具有无抗原性、生物相容性和细胞亲和性较好等特点[5]。本研究所选择的是以上两种不同类型细胞支架的生物材料——PLGA和胶原膜，从扫描电镜结果显示，种植于PLGA上的表皮角质细胞跨过纤维间隙成片生长，并分泌细胞外基质；种植于胶原膜的表皮角质细胞具有良好的伸展状态，细胞表面光滑，平铺于胶原膜生长, 并形成致密的网状结构贯穿于胶原膜中，并有纤维丝状细胞外基质生成。结果表明，这两种生物材料对表皮角质细胞具有较好的黏附性和亲和性。本研究结果还发现，种植于PLGA和胶原膜的表皮角质细胞分泌LDH水平与对照组比较差别无统计学意义，表明它们具有良好的生物相容性，对体外培养表皮角质细胞无毒副作用。因LDH可由受损细胞漏出至培养液中，测定细胞培养液中LDH漏出可客观地反映细胞受损程度。
创面的修复是在机体调控下由细胞、细胞因子、细胞外基质等共同参与完成的，这过程具有高度有序性、完整性和网络性，调控参与创面愈合细胞的趋化、活化、增殖、分化和移行的是生长因子和炎症介质；创面愈合的最终是形成新生表皮覆盖创面，而表皮角质细胞可释放生长因子和细胞因子，与其他创面愈合细胞如成纤维细胞、内皮细胞相互作用，共同完成创面愈合[67]。IL1不仅参与了各种炎症现象，而且还参与新陈代谢和细胞修复，有研究表明表皮角质细胞源的IL1能促进成纤维细胞分泌KGF，从而促进表皮角质细胞增殖；IL6对表皮角质细胞有活化增殖作用，并且能间接诱导表皮角质细胞的迁移；IL8可趋化并激活中性粒细胞，是中性粒细胞激活和迁移的重要调节因子和进入损伤组织的重要炎性介质；同时还能促进表皮角质细胞生长增殖, 加速新生血管形成[810]。本研究结果显示，对照组、PLGA组和胶原膜组表皮角质细胞分泌细胞因子水平随着培养时间的延长呈不同程度地升高，主要是由于细胞增殖因素引起的；而种植于PLGA和胶原膜的表皮角质细胞分泌IL1β、IL6和IL8水平与对照组比较明显增强，则表明PLGA和胶原膜在构建组织工程皮肤中对表皮角质细胞分泌IL1β、IL6和IL8能力具有增强作用，PLGA是PLA和PGA的共聚物，PLA在体内最终降解为二氧化碳和水，随呼吸及尿排出体外，PGA在体内降解为羟基乙酸，易于参加体内代谢；胶原膜则是从牛腱中提取的，主要由Ⅰ、Ⅲ型胶原组成，这两种生物材料能增强种子细胞分泌IL1β、IL6和IL8能力，这为移植组织工程皮肤后促进新生毛细血管的生成，从而保证移植物的存活，对加速创面愈合可能起着积极的作用。
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