| 致谢 | 第5-7页 |
| 中文摘要 | 第7-14页 |
| Abstract | 第14-21页 |
| 论文创新点 | 第22-23页 |
| 缩略词表 | 第23-28页 |
| 引言 | 第28-32页 |
| 实验器材与仪器 | 第32-36页 |
| 1.1 实验试剂 | 第32-33页 |
| 1.2 实验仪器 | 第33页 |
| 1.3 常用实验液体配制 | 第33-35页 |
| 1.3.1 实验相关溶液 | 第33-35页 |
| 1.4 实验动物、细胞株 | 第35-36页 |
| 实验方法 | 第36-46页 |
| 1 细胞的培养 | 第36-37页 |
| 1.1 原代小鼠胚胎成纤维(Mouse embryonic fibroblast,MEF)细胞制作 | 第36页 |
| 1.2 饲养层细胞制备 | 第36-37页 |
| 1.3 小鼠ES细胞支持培养 | 第37页 |
| 2 ES细胞分化培养 | 第37-38页 |
| 2.1 悬滴培养 | 第37页 |
| 2.2 悬浮培养 | 第37页 |
| 2.3 贴壁培养 | 第37-38页 |
| 3 shRNA-Rictor慢病毒表达载体构建和转染小鼠ES细胞 | 第38页 |
| 4 过表达线粒体Cx43慢病毒载体的构建,包装和转染 | 第38页 |
| 5 过表达线粒体Cx43慢病毒转染效率的检测 | 第38-39页 |
| 6 小鼠ES细胞衍生心肌细胞的纯化 | 第39页 |
| 7 Western-blot检测蛋白表达 | 第39-41页 |
| 7.1 蛋白提取 | 第39-40页 |
| 7.1.1 细胞总蛋白提取 | 第39页 |
| 7.1.2 线粒体蛋白提取 | 第39页 |
| 7.1.3 细胞器蛋白提取 | 第39-40页 |
| 7.2 蛋白质印迹 | 第40-41页 |
| 8 流式细胞术检测小鼠ES细胞体外培养分化后的心肌细胞百分率 | 第41页 |
| 9 JC-1染色检测小鼠ES细胞衍生心肌细胞线粒体膜电位变化 | 第41页 |
| 10 免疫荧光检测小鼠ES细胞衍生心肌细胞Rictor定位 | 第41-42页 |
| 11 免疫荧光检测小鼠ES细胞衍生心肌细胞中Cx43在线粒体中定位 | 第42页 |
| 12 免疫荧光检测小鼠ES细胞衍生心肌细胞中线粒体-内质网偶联结构 | 第42页 |
| 13 透射电镜观察小鼠ES细胞衍生心肌细胞中线粒体、MAM结构 | 第42-43页 |
| 14 检测小鼠ES细胞衍生心肌细胞的线粒体钙瞬变 | 第43页 |
| 14.1 溶液配制 | 第43页 |
| 14.2 操作步骤 | 第43页 |
| 15 EBs及小鼠ES细胞衍生心肌细胞ATP产量的测定 | 第43-44页 |
| 16 免疫共沉淀测定小鼠ES细胞衍生心肌细胞中蛋白的相互作用 | 第44页 |
| 17 EBs及小鼠ES细胞衍生心肌细胞线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性测定 | 第44页 |
| 18 小鼠ES细胞衍生心肌细胞线粒体通透性转换孔(mPTP)开放的检测 | 第44-45页 |
| 19 数据分析 | 第45-46页 |
| 第一部分 Rictor/mTORC2在小鼠ES细胞分化为心肌细胞中对线粒体功能的影响 | 第46-58页 |
| 1 实验结果 | 第46-55页 |
| 1.1 Rictor/mTORC2在小鼠ES细胞衍生心肌细胞中的表达及定位 | 第46-48页 |
| 1.2 干扰小鼠ES细胞Rictor表达对mTORC2完整性和活性的影响 | 第48-49页 |
| 1.3 干扰Rictor导致小鼠ES细胞定向心肌细胞分化中线粒体损伤 | 第49-55页 |
| 1.3.1 干扰Rictor影响小鼠ES细胞定向分化为心肌细胞中ATP合成 | 第49-50页 |
| 1.3.2 干扰Rictor对ESC-CMs的线粒体膜电位和凋亡相关蛋白的影响 | 第50-52页 |
| 1.3.3 干扰Rictor影响ESC-CMs线粒体形态结构 | 第52页 |
| 1.3.4 干扰Rictor对ESC-CMs线粒体钙流动的影响 | 第52-55页 |
| 2 讨论 | 第55-56页 |
| 3 小结 | 第56-58页 |
| 第二部分 干扰Rictor通过线粒体Cx43影响小鼠ES细胞分化心肌细胞线粒体功能的机制研究 | 第58-70页 |
| 1 实验结果 | 第58-67页 |
| 1.1 干扰Rictor对ESC-CMs线粒体Cx43的影响及机制 | 第58-61页 |
| 1.1.1 干扰Rictor影响ESC-CMs线粒体和胞浆Cx43表达 | 第58-60页 |
| 1.1.2 干扰Rictor对ESC-CMs中Cx43转运到线粒体的影响及机制 | 第60-61页 |
| 1.2 Rictor/mTORC2通过线粒体Cx43调控ESC-CMs线粒体功能的相关机制 | 第61-67页 |
| 1.2.1 特异性过表达线粒体Cx43逆转干扰Rictor所致ESC-CMs线粒体损伤作用 | 第61-63页 |
| 1.2.2 Rictor通过线粒体Cx43调控ESC-CMs线粒体呼吸链酶活性 | 第63-64页 |
| 1.2.3 干扰Rictor通过线粒体Cx43调控ESC-CMs线粒体通透性转换孔的作用及机制 | 第64-67页 |
| 2 讨论 | 第67-69页 |
| 3 小结 | 第69-70页 |
| 总结 | 第70-72页 |
| 参考文献 | 第72-81页 |
| 综述 | 第81-95页 |
| 参考文献 | 第88-95页 |
| 作者简历及在读期间所取得研究成果 | 第95-96页 |
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